[发明专利]一组甲基化基因及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，尤其涉及一种一组甲基化基因及其检测方法。

背景技术

肺癌作为一种常见的恶性肿瘤，近几十年内其发病、死亡率于全球总体上呈上升趋势，在恶性肿瘤中往往处于首位。许多研究都表明，肺癌的发生发展是一个多基因、多因素及多阶段的复杂过程，其大致涉及两大机制，一是表观遗传学层面，二是遗传学层面。其中表观遗传学在肺癌发生发展过程中起着举足轻重的作用，而DNA甲基化则是表观遗传学最重要的一种修饰方式。

DNA甲基化是真核生物体内的一种内源性修饰过程，一般是指由于DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化，生物体把S-腺苷甲硫氨酸(SAM-CH3)中的甲基(-CH3)连接到胞嘧啶核苷酸(Cytosine，C)的第5位残基上，从而使胞嘧啶(C)甲基化为5'-甲基胞嘧啶(5'-Methylcytosine，5'-mC)的过程。胞嘧啶核苷酸(C)能与鸟嘌呤核苷酸(G)通过磷酸二酯键共价结合为二核苷酸(即CpG)。正常健康人基因组中约80％左右的CpG都分散分布在基因组内，且都处于甲基化状态，比如重复序列。另有一小部分CpG则呈高度密集状态，通常当胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的总和超过4种碱基总和的50％左右时，我们把这种富含CpG结构的DNA片段称为CpG岛。通常CpG岛位于5'端的基因启动子、第一外显子以及3'末端区域，且一般处于非甲基化状态。

肿瘤DNA异常甲基化一般有两种形式，即局部相关基因CpG岛的甲基化水平升高以及CpG岛以外的整体基因组DNA的甲基化水平降低。整体基因组DNA的低甲基化水平可能激活原来保持沉默的基因，尤其是ras及fos等原癌基因；而局部相关基因启动子CpG岛的异常高甲基化则可能导致某些基因(尤其是抑癌基因)的转录沉默。而近来一系列研究也已经证实，肿瘤发生发展中某些抑癌基因5'端CpG岛(尤其是启动子区域)会发生异常甲基化，从而使该基因转录受到抑制，这是抑癌基因表达失活的关键。同时研究发现，许多基因的异常甲基化都与肿瘤的发生发展有关，而目前的研究主要集中在4类基因，即抑癌基因(包括p16^INK4a、p15^INK4b、p14^ARF、APC等)、DNA修复基因(MLH1与MGMT等)、代谢酶基因(GSTP1)与肿瘤分子侵袭转移相关基因(DAPK、CDH1等)。这些基因涉及细胞周期调控、细胞间信号转导、细胞凋亡、肿瘤的侵袭转移及DNA损伤修复等过程。

目前针对肺癌的早期诊断依旧相当困难，其早期诊断率低。影像学检查(如常规CT检查)很难检出1cm以下的肿块；而传统的支气管刷检法及痰脱落细胞学法的检测结果也差强人意；作为肺癌临床诊断金标准的病理组织学诊断，一般都需获取组织活检标本，有创，伤害大，对于那些不能耐受手术检查或者不具备相应检查条件的患者往往并不适用，且通过病理检测得到的结果早已失去了早期诊断的意义；肿瘤标志物(尤其是血浆或血清中的分子标志物)的检测来进行肺癌的早期筛查，具有特异性强、敏感度高、标本易获取以及无创等优点，且便于观察预后。近些年，有关肺癌肿瘤标志物研究以及检测方法层出不穷，如“液体活检”技术。此技术就是一种直接从血浆或其他体液中检测循环肿瘤细胞或游离DNA(cfDNA)的技术，有望把肺癌的早期诊断推向一个新的高度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一组甲基化基因及其检测方法，旨在解决目前针对肺癌的早期诊断依旧相当困难，其早期诊断率低，影像学方法(如常规CT检查)很难发现1cm以下的肿块；而传统的支气管刷检法及痰脱落细胞学法的检测结果也差强人意；作为肺癌临床诊断金标准的病理组织学诊断，一般都需获取组织活检标本，有创，伤害大，对于那些不能耐受手术检查或者不具备相应检查条件的患者往往并不适用，且通过病理检测得到的结果早已失去了早期诊断的意义的问题。

本发明是这样实现的，一组甲基化基因，所述一组甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分别为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。

本发明另一目的在于提供一种一组甲基化基因的检测方法，所述一组甲基化基因的检测方法包括以下步骤：

1)抽取受检者外周血20ml，并将其血浆分离；提取上述血浆中的cfDNA,并对其进行亚硫酸盐修饰；