[发明专利]胍基化壳聚糖的制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种胍基化壳聚糖的制备方法，通过对壳聚糖进行胍基化改性，以提高其生物碱性及水溶性，并增强其对电负性细胞膜的作用能力，通过提供的胍基化壳聚糖制备方法，以期提高壳聚糖胍基化的接枝率，避免副反应发生。本发明还提供一种采用胍基化壳聚糖制备抗菌性纳米微球的方法，该方法以硫酸葡聚糖为交联剂，制得包裹有溶菌酶的胍基化壳聚糖纳米微球，其利用胍基化壳聚糖对细胞膜的穿透作用破坏革兰氏阴性菌(G‑)外膜脂质结构的稳定性，使内壁层的肽聚糖暴露出来，进而被溶菌酶水解，通过二者协同作用，增强对G‑的抑制效果。

技术领域

本发明涉及功能高分子材料领域，具体涉及一种胍基化壳聚糖的制备方法及采用胍基化壳聚糖制备抗菌性纳米微球的方法。

背景技术

壳聚糖是自然界中广泛存在的甲壳素脱乙酰产物，分子表面的伯胺基(-NH₂)质子化后带正电，赋予了其抑菌特性，故壳聚糖也是普遍用于食品、医疗、农业等领域的天然抑菌剂。研究表明，高分子量的壳聚糖吸附在细菌细胞表面，可形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内的运输，因此对表层细胞壁结构的革兰氏阳性菌(G+)的抑菌效果显著；而低分子量的壳聚糖则可透过细胞膜进入细菌细胞内，与细胞内带负电的物质结合，使细胞的正常生理功能受到影响，导致细菌死亡，该方式对革兰氏阴性菌(G-)的抑制效果更佳。但是，由于壳聚糖仅可在酸性环境下溶解，故其在中性及碱性环境下的抑菌性能受到了限制。

胍基是目前被发现的自然界中碱性最强(碱性与NaOH相当)的有机碱，其与壳聚糖pKa10.8的伯胺基相比，pKa 12.5的胍基质子化能力更强，同时通过共振互变，形成的亚胺阳离子更加稳定。胍基在生理pH(7.35)环境中能够完全质子化，而且在酸性到碱性很大跨度条件下都能够保持较好的抑菌性能。现有技术中，胍基化壳聚糖的合成主要采用精氨酸在水溶液中以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化，然后与壳聚糖连接的路线，胍基与壳聚糖上伯胺基的接枝效率较低，同时还会与壳聚糖侧链羟基发生副反应。

目前国内外研制的抗菌性药物以抗生素、抗菌肽为主导，抗菌性材料则大多负载了抗菌性药物或复合了金、银、碘等抗菌性粒子。其中，抗生素的抗菌效果显著，但由于长期不合理使用，细菌已对抗生素产生了严重的耐药性，抗生素的应用成为了影响人类及动物长期健康发展的双刃剑；抗菌肽提取于天然生物体中，由10～50个氨基酸组成，富含疏水和碱性氨基酸残基，被认为是最有前途的抗生素替代产品，但作为生物体来源的药物仍不可避免的存在安全性、稳定性、生产成本过高等问题；金、银、碘等抗菌粒子虽具备一定的抗菌特性，但其不可吸收亦不可降解，可用于皮肤表层的抗菌消炎，却不能在体内应用。

溶菌酶是专一作用于细菌细胞壁的天然抗菌蛋白，可通过切断细胞壁的肽聚糖网络从而分解细菌，对表层细胞壁结构的革兰氏阳性菌(G+)的抑菌效果较好。但是，革兰氏阴性菌(G-)的细胞壁表层覆盖了一层脂质外膜难以穿透，其影响了溶菌酶对G-的抑制作用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种胍基化壳聚糖的制备方法，通过对壳聚糖进行胍基化改性，以提高其生物碱性及水溶性，并增强其对电负性细胞膜的作用能力，通过提供的胍基化壳聚糖制备方法，在无水甲醇中以N,N'-羰基二咪唑活化精氨酸，再对壳聚糖进行接枝，以期提高壳聚糖胍基化的接枝率。

本发明还有一个目的是提供一种采用胍基化壳聚糖制备抗菌性纳米微球的方法，该方法以硫酸葡聚糖为交联剂，制得包裹有溶菌酶的胍基化壳聚糖纳米微球，其利用中低分子量胍基化壳聚糖对细胞膜的穿透作用破坏G-外膜脂质结构的稳定性，使内壁层的肽聚糖暴露出来，进而被溶菌酶水解，通过二者协同作用，增强对G-的抑制效果。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种胍基化壳聚糖的制备方法，其包括以下步骤：

步骤一、羧基活化精氨酸的制备：取精氨酸与N,N'-羰基二咪唑的摩尔比为1：0.2～5，溶于无水甲醇中反应1～5h，反应温度为-20～25℃，备用；