[发明专利]同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重PCR引物及其检测方法

权利要求书

1.一种同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重PCR引物，其特征是引物对如下：

引物ompC：

正向引物F：5’-AACACTGAAA GCTCCAGCGA-3’；

反向引物R：5’-CGTCGGTACG TTTGGAGTGA-3’；

引物ahal：

正向引物F：5’-AGACGGTACC ACTTTCGACG-3’

反向引物R：5’-ATGTGACGCG GGTCTATGTC-3’。

2.权利要求1所述同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的检测方法，其特征是：以引物ompC和引物ahal为靶基因，通过双重PCR方法，以待检样品DNA为模板，以引物ompC和引物ahal扩增靶基因，检测是否存在扩增产物，有对应条带则表明检测结果为阳性。

3.如权利要求2所述同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的检测方法，其特征是具体步骤如下：

（1）肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的DNA提取：扩大培养肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌，采用常规细菌基因组DNA抽提试剂盒提取肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌菌液的DNA，溶解在pH7.5的TE缓冲液中，置于-20℃保存备用；

（2）双重PCR反应：引物ompC和引物ahal在同一反应体系中同时进行双重PCR反应，其中取浓度均为100mmol/L的上下游引物各0.5-1μL，

（3）电泳检测：取5-10 µL PCR检测产物，在1%含goldview染色剂的琼脂糖凝胶上电泳检测，结束后将胶放在凝胶成像系统下观察结果并拍照记录；

（4）结果分析：在418bp位置处有扩增条带代表样品中含有肺炎克雷伯氏菌，213bp位置处有扩增条带代表样品中含有豚鼠气单胞菌；若对应位置无扩增条带，表示样品为阴性，待检测样品中不含有肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌。

4.如权利要求3所述同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的同步检测的方法，其特征是：步骤（2）中PCR反应条件及检测体系具体如下：

PCR检测体系：两组浓度均为100mmol/L的上下游引物各0.5-1μL，含Mg²⁺的10×Buffer 3-4μL，浓度为25g/L dNTP 2-3 μL，Taq酶0.2 µL，DNA模板各1-3 μL，灭菌蒸馏水补齐至25μL；

PCR 反应条件：94℃预变性3-5 min，94℃变性30-45 s、56℃复性30-45 s、72℃延伸30-60 s、30-35个循环，然后72℃温育7min，最后降温至4-12℃。

5.如权利要求3所述同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的同步检测的方法，其特征是：步骤（3）所述电泳检测条件为电压为100-140V，时间为40-60min。