[发明专利]一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法

权利要求书

1.一种定位引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置的方法，其特征在于，包括：

步骤1、将具有特殊生长表型的全合成酵母或半合成酵母与正常生长表型的野生型酵母交配形成二倍体酵母菌株，然后进行生孢培养使所述二倍体酵母菌株发生减数分裂，收集所有孢子，获得杂合单倍体孢子库；或

合成型染色体片段替换正常生长表型的酵母野生型染色体获得的具有特殊生长表型的半合成酵母，通过收集替换过程中因同源重组产生的所有转化子，获得杂合单倍体转化子库；

步骤2、根据正常生长表型和特殊生长表型设置选择性培养条件，将杂合单倍体孢子库或杂合单倍体转化子库分为正常表型库和特殊表型库；

步骤3、分别提取正常表型库和特殊表型库中所有菌株的DNA，然后设计全合成酵母或半合成酵母每个功能基因的扩增引物，称为合成型扩增引物，设计野生型酵母每个功能基因的扩增引物，称为野生型扩增引物，以本步骤所述DNA为模板分别进行混合菌落PCR扩增；

步骤4、记录正常生长表型的菌株库DNA采用合成型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，以及特殊生长表型的菌株库DNA采用野生型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，两者重叠的功能基因位置即为引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置；

然后对定位结果进行验证，选择如下两种方式之一：

(1)正常表型菌中，在引起特殊生长表型的序列位置，引入合成型染色体，如果正常表型菌出现全合成酵母或半合成酵母相同的特殊生长表型，则证明序列定位结果正确；

(2)特殊表型菌中，在引起特殊生长表型的序列位置，引入野生型染色体，如果特殊表型菌恢复为野生型酵母正常生长表型，则证明序列定位结果正确；

所述全合成酵母为含有完整合成型染色体的酵母，所述半合成酵母为含有部分合成型染色体和部分野生型染色体的酵母。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述半合成酵母为构建全合成酵母过程中产生的酵母、全合成酵母和野生型酵母发生链交换产生的酵母或合成型染色体片段替换酵母野生型染色体产生的酵母。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述生孢培养为在生孢培养基上于25℃、200转/分钟条件下培养4-7天。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR体系如下：

总体积为20μL，包括10x Taq Buffer 2μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，ddH₂O 14μL，TransFast Taq DNA Polymerase 0.2μL，模板DNA 1μL。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR程序如下：

94℃预变性4min；94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环；72℃延伸3min,4℃保存。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述特殊生长表型为全合成或半合成酵母生长状态相对于野生型酵母生长状态出现差异的特征。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述特殊生长表型选自如下一项或多项：

(1)温度耐受性发生显著变化；(2)目标产物产量发生显著变化；(3)耐药性发生显著变化；(4)对代谢过程中的目标产物或副产物耐受性发生显著变化。