[发明专利]一种TCS-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白、其制备方法和用途

权利要求书

1.一种TCS-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物，所述连接物由TCS-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白定点与乳铁蛋白连接修饰而制备，所述乳铁蛋白作为肿瘤靶向配基修饰在所述TCS-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的C末端；所述TCS-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的巯基与所述乳铁蛋白的马来酰亚胺共价连接，

其中，所述TCS-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白中，TCS 的C端融合穿膜肽，然后与肿瘤蛋白酶底物肽融合，其中，所述TCS、穿膜肽、肿瘤蛋白酶底物肽序列之间各有3~10个甘氨酸作为连接序列；

其中，所述的肿瘤蛋白酶底物肽为MMP-2底物肽；

所述的TCS-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的氨基酸序列为MDVSFRLSGATSSSYGVFISNLRKALPNERKLYDIPLLRSSLPGSQRYALIHLTNYADETISVAIDVTNVYIMGYRAGDTSYFFNEASATEAAKYVFKDAMRKVTLPYSGNYERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSAITTLFYYNANSAASALMVLIQSTSEAARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLAIISLENSWSALSKQIQIASTNNGQFESPVVLINAQNQRVTITNVDAGVVTSNIALLLNRNNMAGGGVSRRRRRRGGRRRRGGGPLALAG。

2.根据权利要求1所述的TCS-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的制备方法，包括如下步骤：

（a）将包含编码TCS-穿膜肽-MMP-2底物肽融合蛋白的基因的重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞，得到含有重组质粒的菌株；

（b）将含有重组质粒的菌株用LB 培养基培养至对数生长期，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导目的蛋白表达；

（c）离心收集菌体并超声破碎；

（d）离心，收集含有目的蛋白的上清液；将所述上清液用几丁质柱亲和纯化，洗去杂蛋白后，用含有L-半胱氨酸的缓冲液进行柱上切割过夜，收集洗脱液；

（e）将洗脱液超滤浓缩并除去溶液中的游离半胱氨酸，即得到TCS-穿膜肽-MMP-2底物肽融合蛋白；

（f）将乳铁蛋白与马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺按摩尔比1:3~1:20 在PBS 溶液中进行反应，于室温中反应0.5~4小时，并用脱盐柱除去多余的马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺，得到活化后的乳铁蛋白；

（g）将所述的TCS-穿膜肽-MMP-2底物肽融合蛋白与步骤（f）中活化后的乳铁蛋白按摩尔比1:5~1:20 进行反应，于4 摄氏度反应过夜；

（h）用阳离子交换柱来分离纯化从步骤（g）中得到的TCS-穿膜肽-MMP-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物。

3.权利要求1 所述的TCS-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为MMP-2酶高表达的恶性脑胶质瘤。