[发明专利]一个可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体

说明书

本发明涉及植物病毒学和分子生物学，提供了一个烟草丛顶病毒(TBTV)RdRp蛋白的原核表达载体。该质粒载体名称为pMAL‑TB‑RdRp，含有TBTV中国分离物的RdRp编码序列。该质粒作为TBTV RdRp蛋白的原核表达载体，其原核表达产物通过亲和层析纯化可获得有活性的RdRp蛋白，建立RdRp介导的体外复制研究体系，此体外复制体系将来可用于TBTV复制调控的研究。

技术领域

本发明涉及植物病毒学和分子生物学，提供了一个可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体。

背景技术

烟草丛顶病(tobacco bushy top disease)于1958年在非洲津巴布韦首次报道，后陆续在其邻国，以及亚洲的巴基斯坦、泰国发现。90年代，在云南保山、三江流域爆发流行，在部分烟区造成毁灭性灾害。目前，该病在大理、保山和玉溪等主要烟区零星发生。感病烟株叶色淡绿或黄化，并伴有系统坏死枯斑或坏死线纹，苗期感病烟株严重矮化、缩顶，叶片变小，而晚期感病的烟株腋芽过度增生，株型成为密生小叶、小枝的丛枝状塔型。

烟草丛顶病通常由番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)幽影病毒属(Umbravirus)成员烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)及黄症病毒科(Luteoviridae)的烟草扭脉病毒(Tobacco vein distorting virus,TVDV)复合侵染引起。自然条件下，烟草丛顶病主要由蚜虫传播；发病烟苗的汁液摩擦接种健康烟苗也可致病，但造成TVDV的丢失，且不能被蚜虫传播；表明TVDV不能通过机械接种传播，TBTV单独接种烟苗即可发病。

莫笑晗等于2003年报道了TBTV中国分离物的基因组全序列。TBTV的基因组是一条(+)ssRNA，由4152个核苷酸组成。其基因组编码4个蛋白，其中ORF1和ORF2的编码框重叠存在，表达产物是病毒的复制酶(RdRp)组分，ORF3蛋白可能参与病毒的长距离运输，ORF4蛋白可能是病毒细胞间运动的功能蛋白。与其他幽影病毒属成员相似，TBTV 5’端非编码区很短(10nt)，ORF1编码35kD的蛋白，ORF2则编码98kD的蛋白，是ORF1通过-1位的移码翻译机制表达产生，其N端与ORF1蛋白序列相同，ORF2蛋白具备RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependentRNA polymerase，RdRp)活性。RdRp活性蛋白参与TBTV基因组的复制，直接决定TBTV在植物体内的复制水平和致病性。然而目前没有独立研究TBTV RdRp调控基因组复制的研究体系，同时由于TBTV RdRp是移码产物，植物体内表达量很低；有必要通过原核表达获得RdRp，进而建立体外复制体系进行复制调控的独立研究；但是现有技术标明具备RdRp活性的蛋白在原核表达、纯化过程中容易造成活性丧失，因而无法建立体外复制体系，因而根据现有技术是无法建立体外复制体系的。

发明内容

本发明提供了一个烟草丛顶病毒(TBTV)RdRp蛋白的原核表达载体。该质粒载体名称为pMAL-TB-RdRp，含有TBTV中国分离物的RdRp编码序列。该质粒作为TBTV RdRp蛋白的原核表达载体，原核表达产物通过亲和层析纯化可获得有活性的RdRp蛋白，建立RdRp介导的体外复制研究体系。

发明人首先公开了一个可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体，该质粒载体名称为pMAL-TB-RdRp，含有TBTV中国分离物RdRp蛋白的编码序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示，氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

该质粒载体的原核表达产物经亲和层析纯化，利用纯化后蛋白构建体外复制体系，可利用TBTV特异RNA片段为模板合成其互补链，此TBTV RdRp介导的体外复制体系，可为进一步定性定量研究TBTV基因组复制调控奠定基础。

发明人还公开了该可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体pMAL-TB-RdRp的构建方法如下：