[发明专利]一种高稳定型MazF突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种高稳定型MazF突变体及其应用。本发明提供了一种蛋白质，为如下1)或2)：1)所示的蛋白为将野生型MazF蛋白氨基酸序列中第48位半胱氨酸置换为丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，得到的蛋白；2)所示的蛋白为将1)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明了，突变体在野生型序列48位发生氨基酸替换，该突变体在保持了野生型MazF毒蛋白相当的核酸内切酶活性的条件下，有效提高了活性保持时间与结构稳定性。该突变体可用于各类基于mazEF毒素‑抗毒素系统建立的合成生物学模块，在细菌TAs自杀机制研究、抗菌及抗病毒具有广泛应用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高稳定型MazF突变体及其应用。

背景技术

毒素-抗毒素系统(Toxin-Antitoxin system，TA)是原核生物中的一对基因操纵元件，通常为中间有一个或数个碱基重叠的相邻基因，分别编码一个稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素，可以在细菌应对各种胁迫条件时诱导其生长抑制或程序性死亡，具有重要的生理调节功能。在典型的TA中，抗毒素基因编码的不稳定抗毒素易被降解，使毒素能够从毒素-抗毒素复合物中得以释放,进而发挥其毒性作用。TA最先发现于低拷贝质粒上，通过“分离后致死”效应维持质粒的稳定传递，随后被发现大量存在于细菌的基因组中。毒素蛋白的作用靶标很多，已经明确的包括破坏细胞膜、抑制细胞壁形成、剪切mRNA及rRNA、抑制核糖体亚基的功能及抑制螺旋酶的活性等。其中，对细胞最重要和常见的毒性表现为对翻译水平的调控，进而导致细菌的生长抑制或死亡。

由于基于TA编码的毒素对细菌的显著抑制活性，对其采用人为干预的方式进行激活，释放毒素进而杀死致病菌的抗菌策略已引起了广泛关注。与传统的抗生素治疗原理不同，该策略利用了细菌特有的TA基因元件，由于未经过临床上的筛选压力，因而在对抗耐药菌方面有独特的优势。此外，这种利用细菌内源毒素的策略不仅对人及其它高等生物的安全性较高，而且不易导致新耐药菌的产生。

根据抗毒素与毒素的特性与作用机制的不同，已经发现的TA可以分为六种类型，其中最为典型的是II型。II型TA的毒素和抗毒素为两个相互作用的蛋白，抗毒素通过与毒素的结合中和毒素的活性。由于抗毒素不稳定，易被ClpXP和Lon蛋白酶降解，得以释放毒素，导致细菌的生长抑制或死亡。

目前，研究最为充分的II型TA是大肠杆菌来源的mazEF基因元件,分别编码毒素MazF和抗毒素MazE。MazF是一种特异剪切ACA位点的RNA内切酶，可以高效剪切mRNA和rRNA。蛋白质晶体结构研究发现，MazE对MazF的中和作用是通过与MazF形成一个六聚体结构(包含2个MazE和4个MazF)实现的。由于其机构和活性的深入解析，MazE/MazF被广泛应用于体内、体外的抑菌模型及相关实验中，对于研究基于TA的新型抗菌(特别是抗耐药菌)策略具有重要的意义。此外，将MazF蛋白的表达和激活与病毒相关的生物信号分子相结合，在抗HIV和HCV病毒方面也得到了应用。

Engelberg-Kulka研究组发现一种由大肠杆菌产生的群感分子EDF(extracellular death factor)能够通过作用于mazEF系统诱导细胞死亡。EDF是一个序列为NNWNN的五肽，由zwf基因的mRNA经过特定剪切及翻译后ClpXP蛋白酶的修饰而形成，通过与MazF关键位点的结合抑制MazE/MazF复合体的形成,从而激活MazF并显著增强其毒性。Nora R等建立了一种以两端修饰的嵌合核酸为底物的MazF体外活性评价方法，该底物中间含有一个可以被MazF剪切的ACA，通过剪切后底物荧光强度的升高来定量评价MazF蛋白的活性。采用类似的方法，可以在体外条件下进行毒素活性、抗毒素与毒素的相互作用、以及可以干扰TA正常作用的小分子筛选(例如EDF类小分子)等研究工作。