[发明专利]一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法

权利要求书

1.一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

将印迹底物加入到磷脂酶D溶液中，搅拌30～120min，得到酶-底物配合物，其中：

所述的印迹底物为丙三醇或磷脂酰胆碱；

所述的磷脂酶D溶液为磷脂酶D的醋酸缓冲液；

每1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液中对应加入0.01～0.1g丙三醇；或者每1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液中对应加入0.1mL含有磷脂酰胆碱浓度为0.1～1mg/mL的乙醚溶液；

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加无水沉淀剂并搅拌，滴加完毕后，继续在搅拌下沉淀10～30min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液，其中：

每1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液中对应加入8～10mL无水沉淀剂；

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

向步骤二中得到的混合溶液中加入水溶性交联剂进行交联反应60～120min，反应结束后离心收集产物，得到交联酶-底物配合物聚集体，其中：

水溶性交联剂的质量浓度控制在0.5％～2.5％之间；

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

将步骤三中得到的交联酶-底物配合物聚集体用纯化溶剂洗去酶分子的配合底物，再用去离子水洗去未交联的酶分子，冷冻干燥，得到交联印迹磷脂酶D聚集体。

2.如权利要求1所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，所述的步骤一、步骤二和步骤三均在冰浴条件下进行。

3.如权利要求1所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤一中，所述的醋酸缓冲液的浓度为0.2M，pH值为5.0～6.0。

4.如权利要求1所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤二中，所述的无水沉淀剂降温至0℃以下后再加入到磷脂酶D-底物配合物溶液中。

5.如权利要求1所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤二中，所述的无水沉淀剂为无水乙醇。

6.如权利要求1所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤三中，所述的水溶性交联剂为戊二醛。

7.如权利要求1所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤四中，若印迹底物为丙三醇，则对应的纯化溶剂为去离子水；若印迹底物为磷脂酰胆碱，则对应的纯化溶剂为无水乙醇。

8.如权利要求1所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤四中，所述的交联印迹磷脂酶D聚集体置于4℃下保存。