[发明专利]一种猪源胶原膜‑自体软骨细胞复合支架的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程关节软骨损伤修复治疗领域，具体来说是一种猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的构建方法。

背景技术

关节问题比较常见，其发生在人的各个年龄阶段，关节软骨缺损可导致受伤，关节受伤由超出正常的的运动引起，或过度使用、肌无力、一般磨损引起，不同的软骨缺损需要不同的治疗。

目前软骨缺损常用的治疗方法包括骨髓刺激法、同种骨软骨移植、同种软骨细胞移植法、自体软骨细胞移植、组织工程修复法等，但这些技术依然存在各种各样的问题。

骨髓刺激法破坏软骨缺损部位的软骨下骨的连续性，来自骨髓的基质干细胞及生长因子促进软骨修复，具体实施方法有：磨削关节成形术、软骨下骨钻孔术、微骨折术，其中微骨折术较为容易实施，因此应用最为广泛，但修复结果并不理想，多数为纤维软骨修复，而不是透明软骨修复，纤维软骨修复在后期极易引起骨关节炎的发生。

同种骨软骨移植是一种将非负重区及非重要关节部分的骨或软骨植入软骨缺损表面以达到修复目的的技术，具有保持软骨生物化学和生物机械特性的优点，但低温冷冻保存的软骨极易坏死，且极易出现感染症状，而且出现大面积软骨缺损失时，很难找到合适的供体软骨，目前该方法进一步优化，将缺损区域清创，从非负重关节区域取相应大小的柱状软骨移植到缺损区域，但这仍然无法修复大面积软骨缺损，也有一些移植物会脱落。

同种软骨细胞移植法是将分离培养的软骨细胞直接注射到软骨缺损部位，但修复效果并不能令人满意，主要是由于移植软骨细胞无法在移植部位固定和生长。后来纤维蛋白胶的应用改良了固定的效果，修复效果也因此得到提高。但同种软骨细胞移植可能引起免疫排斥反应及感染或引起疾病传播。

自体软骨细胞移植是从关节软骨活体组织中分离软骨细胞并进行扩增，然后将扩增的自体软骨细胞注射到缺损区域并用骨膜瓣覆盖，优点是不存在免疫排斥及感染问题，临床上应用比较容易，缺点是采集软骨而对正常软骨造成损伤，且软骨细胞分布不均匀等。

组织工程修复关节软骨缺损是在体外培养扩增软骨组织细胞，并且以较高浓度将其种植在具有良好的生物兼容性和降解性的合适支架材料上构建组织工程软骨，然后植入组织缺损部位，软骨组织工程有三个要素：一定数量的种子细胞、合适的支架材料、体外培养条件优化，近来人们在人工合成材料表面复合生物高分子，如胶原蛋白、琼脂糖凝胶、藻酸盐、壳聚糖等，使其兼具生物和人工合成材料的优点，目前仍存在一些问题，如种子细胞选择以及体外培养体系不成熟、构建的支架材料不理想、体内吸收过快、机械性能不理想、形成的软骨组织力学性能差、后期容易退化、对修复的分子机制还不清楚等，尚需进一步研究。

如前所述，以上治疗方法存在着各种各样的问题，限制了这些技术的临床应用，需要进行改进。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中的治疗效果不好的缺陷，提供一种猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的构建方法来解决上述问题。

本发明公开了一种猪源胶原膜-自体软骨细胞复合支架的构建方法，具体步骤为：

（1）、取患者非承重区的关节软骨约200-300mg，剔除干净软组织，将剩余透明的软骨组织块放入盛有PBS缓冲液的离心管中，震荡清洗，直至残留的血液漂洗干净为止；

（2）、在无菌平皿中，用眼科剪刀将软骨组织剪碎成1 mm³的碎片；

（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎块30min，吸弃上清；

（4）、再用0.02%（m/v）Ⅱ型胶原酶5ml于37℃，5%的CO2 培养箱中对碎片消化8-10h，其中每隔1小时震荡一次，直至成絮状，得到细胞悬液；

（5）、采用100um滤网对细胞悬液进行过滤，加入含FBS的高糖DMEM 培养基终止消化，其中高糖DMEM 培养基中的FBS的体积浓度为10%，在1000-1500rpm的条件下,离心5min，弃上清，沉淀即为软骨细胞；

（6）、将软骨细胞用含FBS、庆大霉素的高糖DMEM 培养基悬浮，调节至1×10⁸/L，其中高糖DMEM 培养基中的FBS的体积浓度为10%，高糖DMEM 培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml，然后接种于25cm²培养瓶内，每瓶5ml，置于37℃，5%的CO₂培养箱培养，每隔3天更换高糖DMEM 培养基一次，其中该高糖DMEM 培养基中也含10%FBS、45ug/ml庆大霉素；

（7）、待软骨细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；