[发明专利]一种肝星状细胞分离制备方法

权利要求书

1.一种肝星状细胞分离制备方法，通过灌注、剥离、密度梯度分离得到肝星状细胞，其特征在于，灌注过程中先后用灌注液I、灌注液II、灌注液III进行灌注；

其中，所述灌注液I包括缓冲液I；

所述灌注液II由每毫升缓冲液II加入0.22~0.38mg链霉蛋白酶E构成；

所述灌注液III由每毫升缓冲液II加入0.52~0.68mg胶原酶D构成；

所述缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7000~9000 mg，KCl 350~450 mg，NaH₂PO₄·H₂O 80~100 mg，Na₂HPO₄ 100~140 mg，HEPES 2200~2600 mg，NaHCO₃ 300~400 mg，EGTA150~250 mg，Glucose 800~1000mg，其余为H₂O；

所述缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7000~9000 mg，KCl 350~450 mg，NaH₂PO₄·H₂O 80~100 mg，Na₂HPO₄ 100~140 mg，HEPES 2200~2600 mg，NaHCO₃ 300~400 mg，CaCl₂·2 H₂O 500~620 mg，其余为H₂O。

2.根据权利要求1所述的肝星状细胞分离制备方法，其特征在于，

所述灌注液II由每毫升缓冲液II加入0.3mg链霉蛋白酶E构成；

所述灌注液III由每毫升缓冲液II加入0.6mg胶原酶D构成。

3.根据权利要求1所述的肝星状细胞分离制备方法，其特征在于，剥离过程中，将经灌注处理后的肝脏置于平衡溶液中漂洗并剪碎，然后在解离液中孵育，过滤离心，弃上清，用含脱氧核糖核酸酶I的平衡溶液重悬细胞；

其中，所述平衡溶液包括缓冲液III；

所述解离液由每毫升缓冲液II加入0.45~0.55mg链霉蛋白酶E、0.45~0.55mg胶原酶D和0.015~0.025mg脱氧核糖核酸酶构成；

所述缓冲液III每升包括下述重量份的各组分：KCl 320~420mg，MgCl2·6 H₂O 170~250mg，MgSO4·7 H₂O 60~80mg，Na₂HPO₄ 50~70mg，KH2PO4 25~35mg，Glucose 890~1100 mg，NaHCO₃ 190~270 mg，CaCl₂·2 H₂O 185~265 mg，其余为H₂O。

4.根据权利要求3所述的肝星状细胞分离制备方法，其特征在于，所述解离液由每毫升缓冲液II加入0.5mg链霉蛋白酶E、0.5mg胶原酶D和0.02mg脱氧核糖核酸酶构成。

5.根据权利要求1所述的肝星状细胞分离制备方法，其特征在于，密度梯度分离过程中，将经灌注、剥离处理得到的细胞悬液先后加入平衡溶液和离心液A，混匀后移入预先加入离心液B的容器中，再加入平衡溶液，离心，回收肝星状细胞；

其中，所述平衡溶液包括缓冲液III；所述离心液A包括由每毫升缓冲液III加入0.15~0.25g密度梯度分离试剂构成；所述离心液B由每毫升缓冲液III加入0.08~0.12g密度梯度分离试剂构成；

所述缓冲液III每升包括下述重量份的各组分：KCl 320~420mg，MgCl2·6 H₂O 170~250mg，MgSO4·7 H₂O 60~80mg，Na₂HPO₄ 50~70mg，KH2PO4 25~35mg，Glucose 890~1100 mg，NaHCO₃ 190~270 mg，CaCl₂·2 H₂O 185~265 mg，其余为H₂O。