[发明专利]基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程关节软骨损伤修复治疗领域，具体来说是一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法。

背景技术

关节软骨损伤在临床上是一种常见的疾病，临床表现为关节疼痛，负重、运动则加重，限制了患处关节的活动,多发病于运动员、年老者,由于关节软骨是透明软骨，缺乏血管、淋巴、神经营养等，因此很难自我修复,一旦发病，则往往发展为骨性关节炎，重者需要人工关节置换。

这一疾病的治疗以前有过多种治疗手段，包括清创术、骨髓刺激术（如微骨折术、软骨下骨钻孔术等）、自体或异体软骨膜和骨膜移植术、骨软骨移植术、关节软骨移植术等,但这些技术修复组织多以纤维软骨为主、缺乏正常透明软骨的力学性能及耐用性，同时也常常会出现一些并发症如修复后过度生长、骨膜增生、关节肥大、损坏正常组织、疾病传染等。

随着自体软骨细胞移植技术（Autologous chondrocyte implantation, ACI）的成熟，软骨损伤修复治疗逐渐进入组织工程修复领域,第一代ACI技术多采用自体骨膜瓣，易形成骨膜肥大，骨膜增生伸入关节腔往往需要二次手术切除,移植的骨膜也使软骨下骨密度增加，导致新生软骨组织退化，移植的骨膜生成的透明软骨样组织的生物力学性能、耐磨持久性不佳，易蜕变，整个手术过程操作复杂，费用高昂。

第二代细胞疗法采用一种可吸收的支架替代自体骨膜，减少了对健康组织的损害,但其仍需两次手术，仍需缝合，技术相对复杂，细胞分布不均衡，存在细胞流失的风险。

第三代的细胞疗法则对以上技术进一步优化，将自体软骨细胞移植入一种可吸收的膜支架，并继续培养一些天，可使细胞均匀分布于胶原膜中,然后将这一细胞胶原膜植入软骨损伤处进行修复，被称为基质诱导的自体软骨细胞移植技术（Matrix-induced autologous chondrocyte implantation (MACI)）,这一技术术后恢复时间短，操作简便、创伤小、修复面积达，可达20cm²，术后产生更多的透明软骨,治疗效果较为理想,这也避免了之前技术所引起的并发症。然而MACI技术仍然需要采集患者自体软骨细胞，损坏正常软骨组织，仍需二次手术，增加了患者痛苦，同时治疗费用昂贵。

另一方面，随着组织工程技术的发展，干细胞技术日益成熟，其在医学上应用也越来越被关注。由于干细胞具有组织全能性，能分化成各种组织细胞，尤其是可分化成软骨细胞，这使其在临床上应用于修复软骨损伤成为可能。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中的检测精确度差、灵敏度不足的缺陷，提供一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法来解决上述问题。

本发明公开了一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，具体步骤为：

（1）、在无菌条件下，使用20ml的注射器，将1ml肝素钠生理盐水抽吸入注射器内，然后继续使用注射器抽入骨髓9ml，去掉针头后，将肝素钠生理盐水和骨髓加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混合均匀后，得到骨髓悬液；

（2）、在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封；

（3）、将患者的外周血分装于50ml离心管中，每管45ml,在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；

（4）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，离心20min，然后吸取中间白膜层，然后向白膜层内加入50ml PBS，并吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；

（5）、向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，然后取15ml 含自体血清和硫酸庆大霉素的DMEM高糖培养基加入到目的细胞内，然后将细胞吹打均匀，并计数，以5×10⁵/ cm²接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的CO₂培养箱中培养，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基,该DMEM高糖培养基也含10%自体血清和40U/ml硫酸庆大霉素；