[发明专利]提高安丝菌素P-3生物合成产量的方法

说明书

一种提高安丝菌素P‑3生物合成产量的方法，通过构建asm13‑17基因的表达质粒pIB139‑asm13‑17、构建asmUdpg基因的表达质粒pIB139‑asmUdpg以及构建共表达asm13‑17基因和asmUdpg基因所对应的整合型表达质粒pIB139‑asm13‑17:asmUdpg，并将上述表达质粒分别转入珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中，实现生物合成表达量的提高，本发明能够显著提高安丝菌素P‑3的发酵水平。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种通过提高前体供应的代谢工程手段来改善安丝菌素P-3生物合成产量的方法。

背景技术

放线菌(Actinomycete)是合成抗炎症、抗肿瘤药物的重要微生物。作为原核生物类群之一的放线菌在自然界分布很广，已发现的抗生素中约有三分之二是放线菌产生，与人类关系十分密切。安丝菌素是珍贵橙色束丝放线菌中产生美登醇类抗肿瘤化合物(Higashide E等，Nature，2002，270(5639)：721-722)，其中的主要成分是P-2，P-3和P-4，药理研究报道表明该类化合物具有治疗白血病和肺癌的作用，其中以安丝菌素P-3(AP-3)的抗肿瘤活性为最佳。AP-3抗体偶联药物曲妥珠单抗在欧美作为乳腺癌的靶向治疗药物已于2013年2月经美国FDA批准上市(Chari R等，Angewandte Chemie International Edition，2014，53(15)：3796-3827)。近年的研究发现，AP-3的侧链修饰结构类似物，对肺癌和肾癌具有很强的抗增殖活性(Taft F等，Chemistry-A European Journal，2012，18(3)：880-886)，展示了AP-3及其衍生物良好的应用前景。但是，目前AP-3生物合成产量仍较低，这限制了其广泛的商业化应用，因此，提高AP-3的生物合成产量具有重要的应用价值。

为了进一步提高AP-3的发酵水平，目前报道提高的AP-3产量的方法主要集中在突变株筛选、培养基优化以及培养工艺优化等方面。通过紫外和MNNG诱变技术结合得到一株高产突变株Actinosynnema pretiosum PF4-4(ATCC PTA 3921)摇瓶发酵20mL/250mL条件下最终确认有效的产量最高可以达到401mg/L，在1500L发酵罐中通过优化分批补料工艺，最终产量为304mg/L。而使用常用的菌种Actinosynnema pretiosum ATCC 31565生产AP-3，国内早期采用铺有可再生纤维素薄膜的固体发酵培养基平板培养下，产量最终可以达到4mg/g(干重)。

安丝菌素P-3的合成是一个典型的聚酮合酶I(PKS I)催化过程，它以3-氨基-5羟基苯甲酸(AHBA)作为起始单位，在PKS酶I催化下，延伸单位(3个丙二酰辅酶A，3个甲基丙二酰辅酶A以及1个特殊的羟乙酸盐单位-甲氧基丙二酰ACP)与起始单位进行缩合反应成环后，形成前安莎结构，然后经过氯化、甲氨酰化、O-甲基化、酰基化、环氧化和N-甲基化六步后修饰反应最终生成AP-3。其中小型基因簇asm13-17负责特殊前体羟乙酸盐单位合成，AHBA途径由主代谢中的UDP-葡萄糖起始，经过10步反应得到AHBA前体。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种提高安丝菌素P-3生物合成产量的方法，通过在生产菌株中引入不同前体的合成基因，通过代谢工程手段提高特殊的前体--羟乙酸盐单位的供给以及耦合AHBA前体途径供给增加，能够显著提高安丝菌素P-3的发酵水平。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明通过构建asm13-17基因的表达质粒pIB139-asm13-17、构建asmUdpg基因的表达质粒pIB139-asmUdpg以及构建共表达asm13-17基因和asmUdpg基因所对应的整合型表达质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，并将上述表达质粒分别转入珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中，实现生物合成表达量的提高。