[发明专利]重组枯草芽孢杆菌串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1－F2蛋白

说明书

一、技术领域

本发明涉及串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1-F2蛋白的重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。具体包括：禽流感病毒HA-PB1-F2蛋白整合表达性质粒pInHAPB1的构建，禽流感病毒HA-PB1-F2蛋白的表达与鉴定以及重组枯草芽孢杆菌可以刺激鸡骨髓源树突状细胞MHC11的表达发生显著变化，诱导树突状细胞的成熟；也可以刺激SPF雏鸡机体产生有效的HA-PB1-F2特异性免疫应答水平。

二、背景技术

1口服黏膜免疫研究进展

目前，在我国控制禽流感最实际有效的方法是使用全病毒灭活疫苗。原因是具有良好的安全性，抗原成分齐全和免疫原性强等特点。但是，传统的疫苗接种(肌肉或皮下注射)具有以下缺点：①动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养，这使得疫苗生产的成本非常高；②疫苗中的病原体可能在疫苗生产过程中没有完全被杀死或完全减毒，从而导致疾病更大范围的扩散；③减毒菌株可能发生突变；④有些疾病使用传统疫苗控制效果不佳(如艾滋病)；⑤导致家禽的应激反应从而影响动物的生长；⑥传统疫苗如果多次接种，会造成体内疫苗残留导致肉类产品质量下降，间接影响食品安全和公共卫生；⑦禽流感感染主要通过呼吸道和胃肠道途径，通过肌肉注射动物的灭活油乳剂疫苗，不能刺激呼吸道和消化道局部粘膜免疫。

新兴的粘膜免疫，具有简单，安全，方便等许多优点，引起国内外免疫学专家的关注，现已成为免疫学研究的热点之一。一方面，粘膜免疫方法简单安全，不仅在粘膜局部和其他粘膜组织产生免疫反应，而且还能引起全身性体液免疫反应；另一方面，有显著的免疫效果，疫苗在口服免疫后通过上呼吸道粘膜相关淋巴组织不仅有效地诱导局部免疫反应，而且激活淋巴细胞归巢到其他粘膜部位，诱导广泛的粘膜免疫应答，防御病原微生物入侵，因此通过口服粘膜免疫能够获得好的效果。例如，口服脊髓灰质炎疫苗的应用，使得脊髓灰质炎的全球发病率得到了有效控制，为口服疫苗的开发和应用起到了引导作用。然而，在实践中，口服粘膜免疫也存在不足，由于疫苗仅作用在粘膜表面，很少能有效地进入动物体，同时也受到膜表面粘液和其他等因素的影响，特别是在经过消化道粘膜时，疫苗很容易被破坏，影响免疫效果，这使得消化道粘膜免疫的使用和推广得到了限制。近年来，疫苗递送已成为传染病防御领域的热点之一。特别是细菌活载体疫苗因培养方便，外源基因容量大，能刺激细胞免疫力的优势具有较大潜力。因此，理想的疫苗抗原载体的选择是建立新的生物技术的关键。理想的抗原递送载体应该能够在体内长时间存在，本身是安全的并且可以产生持续免疫力。

2枯草芽孢杆菌对口服黏膜免疫的影响

近年来，疫苗递送系统已成为预防传染病领域的热点之一。特别是细菌活载体疫苗因其培养方便，外源基因容量大，刺激细胞免疫等优点具有巨大的潜力。细菌活载体疫苗是新兴的粘膜免疫疫苗的重要发展方向。通过使用细菌活载体疫苗，不仅能刺激肠道免疫反应，而且能够针对特异性抗原产生特异性免疫反应，使机体得到全面保护。目前，研究比较广泛的活菌载体有沙门氏菌、乳杆菌、李斯特菌等。枯草芽孢杆菌是一种安全和非致病的活细菌载体，广泛存在于土壤和植物中，许多研究表明，枯草芽孢杆菌不仅可以诱导肠粘膜免疫应答，也对动物和人的病原体有拮抗作用。作为抗原载体的枯草芽孢杆菌具有许多优点：①是一种安全非致病的益生菌；②有良好的安全性，抗逆性强(适合保存和运输)；③生产方便(发酵条件简单，产品易于分离和纯化)；④遗传操作系统成熟。因此，枯草芽孢杆菌非常适合用于安全口服疫苗和其它病原体的抗原递送载体。同时，作为抗原递送载体的枯草芽孢杆菌可以诱导粘膜免疫应答和全身免疫应答，这都使得应用枯草芽孢杆菌作为抗原递送载体具有广阔的前景。

3枯草芽孢杆菌对树突状细胞的影响