[发明专利]细菌性荚膜多糖的纯化方法

说明书

本发明公开细菌性荚膜多糖的纯化方法，灭活剂处理肺炎链球菌发酵培养液，加酸调节pH值≤6.5，沉淀杂质，离心和微滤去除沉淀物获得多糖澄清液；用截留分子量10—100KDa的膜对多糖澄清液进行超滤换液并浓缩，获得的荚膜多糖溶液组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析进行色谱层析，获得纯化的荚膜多糖溶液；浓缩及超滤荚膜多糖溶液，并进行无菌过滤、保存。通过组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析，可有效降低蛋白质及核酸杂质到低于1％，纯化的多糖产品质量高于欧盟药典标准要求，回收率在60％以上，本发明工艺简单快捷，容易放大进行工业化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地讲，涉及对细菌性荚膜多糖粗制品的纯化方法。

背景技术

肺炎链球菌为革兰氏阳性菌，有90多种血清型，其中大部分肺炎链球菌细菌表面包裹一层荚膜多糖。荚膜多糖可逃避免疫系统的识别，防止免疫细胞的吞噬作用，因而使得细菌能够在体内繁殖而致病。多年的研究和临床证明，肺炎链球菌的荚膜多糖作为疫苗能诱导特异性抗体，对相应的肺炎链球菌具有很好的免疫保护作用。不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖的成分和结构都不一样，因而通常需要使用不同血清型的肺炎链球菌的多糖组合作为疫苗来预防主要肺炎链球菌的致病性。

用于制备多糖疫苗的肺炎链球菌在发酵培养过程中，除了产生荚膜多糖之外，还产生大量代谢产物。为了满足疫苗制备所必须的荚膜多糖纯度，发酵液通常必须经过多个纯化步骤处理，将多糖粗制品中的蛋白、核酸、内毒素等杂质去除，从而避免后续接种疫苗可能引起的副反应。

细菌荚膜多糖纯化工艺的建立经历了多年的发展，传统细菌荚膜多糖纯化工艺采用冷酚萃取法去除蛋白质，该方法需要较长的离心时间，且苯酚作为有一种具有极强腐蚀的试剂，可能腐蚀操作者的皮肤、粘膜甚至抑制操作者的中枢神经或损害肝、肾功能；且废弃苯酚的处理，对环境保护来说存在着较严重的威胁。

乙醇分沉淀法通常能够有效地去除多糖中的蛋白污染物，但是难以达到用于注射用的疫苗纯度的要求。另外，乙醇的使用还会带来以下问题：1)乙醇的使用需要防火设施，而设计这样的设施成本很高；2)需要的乙醇量巨大，每升加工材料几乎需要4-6L乙醇，并且废液处理非常困难；3)处理后的多糖复溶困难，需要冻干等步骤。

专利US5714354提出了一种用无乙醇沉淀来纯化肺炎球菌荚膜多糖的改进方法。该方法是通过用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)来沉淀23种肺炎球菌血清型中的20个荚膜多糖，然后用活性炭过滤、羟基磷酸灰质盐(Hydroxyapatite)色谱法和阴离子交换色谱法来进一步分离多糖中的杂质，该纯化工艺步骤能够纯化出大部分血清型荚膜多糖。该方法纯化出来的所有23个血清型荚膜多糖的质量达到多糖疫苗的质量指标。目前，CTAB已被广泛用来选择性的沉淀多糖，从而达到与蛋白及核酸分离的目的，如专利CN201510012526以及CN200910128141。然而，由于形成的CTAB-多糖复合物解离较为困难，工艺步骤多且繁琐，影响了荚膜多糖的回收率。因此，在专利CN200910128141中，仍然采用纯的乙醇或乙醇和水混合物来溶解CTAB-多糖复合物。

降低多糖发酵溶液的pH值也被专利CN200880012946以及CN201210112391公开用于选择性沉淀蛋白质、核酸，而不严重影响多糖产率。这样纯化方法的特点在于通过酸化这一步来将大部分的污染物(如蛋白、核酸等)和溶液中的荚膜多糖分离，简化了后续工艺，缩短了纯化时间。然而，我们发现获得的制备的多糖不能符合药典标准，仍然需要进一步纯化，包括使用层析色谱吸附残留的杂质，以及微滤、超滤来获得合格多糖。