[发明专利]用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于猪水疱病病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法。

背景技术

猪水疱病病毒(Swine Vesicular Disease Virus,SVDV)是猪水疱病的病原体，根据国际病毒分类委员会(ICTV)第十五次报告(1991)，SVDV归为小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)。病毒粒子呈球形，在超薄切片中直径为22－23纳米，无囊膜，不含脂质和碳水化合物，不能凝集人和家兔、豚鼠、牛、绵羊、鸡、鸽等动物的红细胞，具有一个血清型，四个可区分基因组。相对于口蹄疫病毒，SVDV对pH 2.5-12.0表现稳定。目前，该病在部分国家和地区仍有零星发生，一般只对猪的肥育计划产生轻微影响，未造成大范围的流行和大规模的损失。但从临床角度看，该病的症状与口蹄疫的症状很难区分，从而妨碍了猪和猪产品的贸易与流通，世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病，中国将其列为一类动物疫病。1966年发现猪水疱病以来，世界各国对SVDV的鉴别诊断进行了大量的研究工作。临床上，猪水疱病除了难以与口蹄疫、水疱性口炎等水疱类疾病相区分外，还因从感染SVDV到出现临床症状的时间较长，因此发生猪的水疱性疾病时应立即采集病变样品进行实验室诊断，以确诊疫病的种类。近年来，针对猪水疱性疾病的研究，已有多种实验室检测方法，如：病毒分离试验(VI)、血清中和试验(SN)、病毒中和试验(VN)、酶联免疫吸附试验(直接型、间接型、竞争型，ELISA)、逆转录聚合酶联合反应(RT-PCR)、实时荧光逆转录聚合酶联合反应(Real time RT-PCR)、生物晶片、免疫色层分析测试片(Lateral flow devices,LFD)等方法在国际期刊上发表。根据世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)针对猪水疱病检测方法的推荐情况，不同的适用对象有被推荐使用的不同检测方法，但纵观上述SVDV实验室检测方法，虽然具有各自的优点，但也有不同层面的不足或缺陷，或费时费力，或特异性和敏感性不高，或成本昂贵。近年逐渐发展成熟的环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，其利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，并利用链置换型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在60℃～65℃恒温条件下1h甚至更短的时间即可完成基因扩增。

综上所述，现有的猪水疱性疾病检测方法存在费时费力，特异性和敏感性不高，成本昂贵。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，旨在解决现有的猪水疱性疾病检测方法存在费时费力，特异性和敏感性不高，成本昂贵的问题。

本发明是这样实现的，一种用于检测猪水疱病病毒的荧光引物，所述用于检测猪水疱病病毒的荧光引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于检测猪水疱病病毒的荧光引物的个设计方法，所述合成方法包括以下步骤：

引物的设计根据GenBank数据库中猪水疱病病毒的基因序列，选取其VP1基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子生物学软件LAMP designer1.14设计荧光LAMP引物，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，采用HPLC方式进行纯化；合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100μmol/L溶液，保存于-20℃。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于检测猪水疱病病毒的荧光LAMP引物的猪水疱病病毒检测方法，所述猪水疱病病毒检测方法包括以下步骤：

步骤一，样品核酸的提取按照核酸提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit200说明书提取样品核酸；

步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，Bst DNA polymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL，病毒核酸2.0μL，补水至25.0μL；最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；