[发明专利]一种基于纳米孔单分子技术的手性分子识别和对映体过量检测方法

说明书

本发明提供一种基于蛋白质纳米孔单分子技术的手性分子识别和对映体过量（ee）检测方法。该方法在α‑溶血素蛋白纳米孔内构建了具有双重识别单元的环糊精‑金属二元复合物作为适配体，该适配体与手性分子的不同异构体作用可产生不同特征的电流阻塞信号，由此实现对手性分子的识别和对映体过量（ee）的检测。该方法简单、快速、灵敏，不需要对手性分子进行衍生化，并可实现多种手性分子对映体的同时识别。

技术领域

本发明涉及一种基于纳米孔单分子技术的手性分子识别和对映体过量检测方法，属于单分子分析技术领域。

背景技术

快速、灵敏、准确地识别及检测手性异构体，在催化、医学和生物技术，特别是药物设计和药代动力学等许多领域具有重要意义。但是，由于不同对映体在结合能或反应活性等方面微小的差异，使得对映体分析具有相当大的难度。目前，对映体的手性分析主要有色谱法、质谱法、核磁共振和荧光法等。

蛋白质纳米通道（纳米孔）单分子分析技术是以蛋白质通道/纳米孔（包括天然、基因工程化和化学目标修饰的蛋白质离子通道）为分析元件，借助电化学方法测量分析物通过通道时离子电流（pA级）的变化而建立的单分子分析方法。相比其它单分子分析方法如原子力显微镜（AFM）和单分子荧光分析等，这种方法无需标记和复杂的样品处理，具有简单、快速和灵敏等优点。

在纳米孔单分子检测中，环糊精及其衍生物作为适配体分子以共价键或非共价键结合于纳米孔内，利用分析物和适配体主客体作用可实现对有机小分子的检测。然而，已有的报道和研究表明，β-环糊精及其衍生物适配体与许多手性小分子相互作用比较微弱，很难检测到小分子的电流信号，因此无法用于手性分子的识别。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于纳米孔单分子技术的简单、快速且灵敏的手性分子识别和对映体过量（ee）检测方法。

本发明实现过程如下：

一种纳米孔单分子手性识别和对映体过量检测方法，包括以下步骤：

(1)在电解池顺式（cis）端加入α-溶血素蛋白质，α-溶血素蛋白质插于脂双层形成蛋白质纳米单通道；

(2)在电解池反式（trans）端加入全（6-脱氧-6-氨基）-β- 环糊精（am₇βCD）和可溶性铜盐，在蛋白质纳米单通道内形成环糊精-铜离子复合物；

(3)在电解池顺式（cis）端加入待检测手性分子的不同异构体，记录加入手性分子前后单通道电流，D型与L型对映体在纳米孔内与环糊精-铜离子复合物发生作用，产生不同的特征电流阻塞信号，从而实现手性分子对映体的区分；

(4)测定D型与L型对映体混合物电流阻塞信号，统计D型与L型各自的特征事件数，由事件数计算得到 ee值。

上述步骤（1）中，α-溶血素蛋白质浓度为0.05～0.2 ng/mL。

上述步骤（2）中，全（6-脱氧-6-氨基）-β- 环糊精（am₇βCD）和铜盐的摩尔比为3:1～1:1，所述铜盐为氯化铜、硫酸铜、硝酸铜或醋酸铜，铜盐的浓度为5～100 µM，优选为10～40 µM。

上述步骤（3）中，待检测手性分子的浓度为5～100 µM，优选为10～40 µM。