[发明专利]采用De novo转录组分析鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的方法

权利要求书

1.基于二代测序技术的寻找隐甲藻中与DHA生物合成相关脂肪酸去饱和酶基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)对隐甲藻进行DHA合成的发酵培养：

将新鲜隐甲藻细胞在7.5L的发酵罐中进行补料培养，收集不同生长阶段的隐甲藻细胞进行分析，发现隐甲藻具有显著油脂积累差异特征的阶段，确定最佳样本时期；

2)样本收集,RNA提取及转录组测序：

对步骤(1)所获取差异油脂含量和成分的隐甲藻细胞，利用德国Qiagen公司的RNeasyPlant Mini Kit试剂盒进行微生物细胞总RNA的抽提操作，并利用Ribo-ZeroTM rRNAremoval Kit去除残余rRNA，并分别进行cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成、SPIA扩增、扩增产物的分离纯化，最终得到cDNA文库；

3)转录组测序及数据分析：

对步骤(2)所获取的RNA测序文库，使用美国Illumina公司的HiSeq 2500测序仪，按照说明书进行RNA测序文库的测序及数据分析；

4)基因功能注释与统计分析：

对步骤(3)所获取的转录组结果，使用NGS QC Toolkit、Trinity、以及RSEM等相应生物信息学手段和统计分析，鉴定在油脂和DHA积累阶段特异性表达的脂肪酸去饱和酶；所述利用NGS QC Toolkit软件的数据分析方法为：

对步骤(2)获得的各个样品进行数据过滤：

①去除引物序列；

②去除read 5’端前5bp的碱基；

③ 去除read 3’端质量值低于30的碱基；

5)DHA生物合成关联基因表达的qRT-PCR的验证：

对步骤(4)所获取的与DHA生物合成相关的基因，使用UltraSYBR Mixture对目标基因进行qRT-PCR分析验证

所述方法鉴定到在DHA转换期特异性表达的TR9998 |c0_g1_i1；

所述隐甲藻为寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)，菌株购自美国菌株保藏中心ATCC，代码为ATCC 30556。