[发明专利]一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明的L‑高丝氨酸生产菌株中的一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化，并且/或者一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强，并且/或者一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变。本发明还提供了该生产菌株的构建方法以及其应用。本发明的L‑高丝氨酸生产菌株，具有产量高、成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用。

背景技术

L-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，作为生物合成苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸共有的中间体而少量存在于很多物种中。由于L-高丝氨酸具有L-型-α氨基酸基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此，L-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在药物学、生理学等方面有重要应用前景。

目前，国内外生产L-高丝氨酸主要有以下几种方法：

(1)化学法；该方法合成L-高丝氨酸主要是采用相对昂贵的L-蛋氨酸为原料，并使用具有严重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作为甲基化试剂，经亲核进攻以保护氨基，再在弱碱性条件下水解得到产物。该方法不仅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，对环境不友好；

(2)化学手性拆分方法；该方法是利用混旋的高丝氨酸与手性试剂反应后，会形成非对应异构体的性质差异，由此分离出L-高丝氨酸。该方法产率低，试剂成本高且需使用大量有机溶剂，对环境有较大污染威胁。

(3)生物法；目前主要见报导的是生物酶法，其工艺是利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和L-氨基酸脱氢酶的共同作用下生成氨基酸高丝氨酸。该工艺主要问题仍然是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用价格昂贵的辅酶等。

微生物发酵法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，近年来已经成为生产各类氨基酸的首选工艺。但是，由于高丝氨酸对于细菌生长具有较强的抑制作用(可能是源于其对谷氨酸脱氢酶活性抑制作用，J Bacteriol.1973Nov；116(2):663-72),对L-高丝氨酸的直接发酵生产具有挑战性。因此，目前尚未探索出合适的通过发酵获得L-高丝氨酸的方法。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种L-高丝氨酸生产菌株。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建L-高丝氨酸生产菌株的方法。

本发明要解决的第三个技术问题是现有技术中的生产L-高丝氨酸的方法存在生产成本高、污染大、产率低的问题，进而提供一种可实现低成本、高产量、条件温和、环境污染少的生产L-高丝氨酸的方法。

本发明的L-高丝氨酸生产菌株，所述L-高丝氨酸生产菌株中的一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；

其中，所述被敲除或弱化的基因为thrB、thrL中的一个或两个；所述被突变的基因为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；所述被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。

优选地，所述thrA*为thrA*(G433R)；

具体而言：所述thrB基因的敲除或弱化可阻断或减弱L-高丝氨酸往L-苏氨酸的转化，从而提高L-高丝氨酸的产量；

所述thrL基因为编码前导肽基因，其敲除或弱化可去除或减弱了转录衰减调控，保证thrA基因的转录效率；

所述thrA基因的突变可引入抑制产物的反馈抑制，解除产物的反馈抑制；所述rhtA基因的过表达或增强表达可提高L-高丝氨酸生产菌株对L-高丝氨酸的外运能力，同时提高L-高丝氨酸生产菌株对L-高丝氨酸的耐受性；