[发明专利]一种高活性漆酶突变体蛋白及其制备方法

说明书

本发明涉及医药学技术领域，具体涉及一种高活性漆酶突变体蛋白，其突变体是由野生型漆酶的基因突变得到，所述突变体为CH6‑CotA，CH6‑F207Y，CH6‑V403T，CH6‑P455S，CH6‑TS或CH6‑TSY中的任意一种。本发明以野生型漆酶NH6‑CotA为模板，扩增CotA基因，然后将CotA基因和pET22b载体分别双酶切，酶切产物通过连接、转化和测序构建His标签在C端的突变体CH6‑CotA菌株，然后再通过定点突变和组合突变得到高活性漆酶蛋白的突变体。与野生型漆酶相比，本发明构建的漆酶突变体的活性得到显著提升，从而为漆酶更加广泛地应用于工业生产中奠定了基础。

技术领域

本发明属于医药学技术领域，尤其涉及一种高活性漆酶突变体蛋白及其制备方法。

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种多铜氧化酶，其是从底物吸收电子，传递给氧气生成水，具有环保和高效的特点。漆酶底物范围很广，包括邻苯二酚、对苯二酚、多酚、甲氧基替代酚、氮羟基化合物、苯胺和呈现还原性的有机化合物，因环保高效且具有广泛的底物谱，所以漆酶在很多领域都有巨大的应用潜力，如生物修复、生物合成、生成检测和生物质能源等等。尽管如此，野生型漆酶存在活性低的问题，因此，对野生型漆酶进行改造以筛选高活性漆酶突变体具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种高活性漆酶突变体蛋白。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种高活性漆酶突变体蛋白，其突变体是由野生型漆酶的基因突变得到，所述突变体为CH6-CotA，CH6-F207Y， CH6-V403T，CH6-P455S，CH6-TS或CH6-TSY中的任意一种；CH6-CotA、CH6-F207Y、CH6-V403T、CH6-P455S、CH6-TS、CH6-TSY的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

具体的，CH6-CotA、CH6-F207Y、CH6-V403T、CH6-P455S、CH6-TS、CH6-TSY的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。

本发明的另外一个目的是提供一种如上所述的高活性漆酶突变体蛋白的制备方法，其步骤如下：

a）引物设计：CH6-CotA的正、反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8所示；CH6-F207Y的正、反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；CH6-V403T的正、反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；CH6-P455S的正、反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示；

b）DpnⅠ酶切消化：分别用各对正、反向引物对pET22b/CotA质粒（CotA基因来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168，经克隆后连接到pET22b载体上）进行扩增，将扩增产物用DpnⅠ酶在35-40℃下酶切4.5-5.5h，扩增条件：94℃，5min；94℃，1min；68℃，30s；72℃,1min，循环30次；72℃，5min；4℃保温；

c）退火、纯化回收：将酶切产物混合，72℃反应10 min后室温退火，将退火后的产物用试剂盒（Universal DNA Purification Kit，全式金生物技术公司）纯化回收；

d）转化、测序：将回收产物转化到感受态DH5α大肠杆菌中，平板培养，挑取单菌落测序，得测序正确的高活性漆酶衍生物的突变体CH6-CotA菌株、CH6-F207Y菌株、CH6-V403T菌株、CH6-P455S菌株；