[发明专利]一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法的检测试剂。

背景技术

埃博拉病毒是一种能引起的人畜共患烈性传染病的丝状病毒科病毒，能引起埃博拉出血热，具有高致病性，病死率高的特点，被世界卫生组织列为对人类危害最严重的病毒之一，生物安全等级4级(BSL-4)。

目前，我国扎伊尔型埃博拉病毒常规检测方法有血清学反应、核酸杂交、抗原抗体ELISA等技术，但这些试验或方法，存在操作繁琐，所需时间长(约2天以上)。现有扎伊尔型埃博拉病毒检测技术依然很少，且大多并不可靠，灵敏度低、特异性差。过去推广使用的核酸检测方法于2014年西非疫情中被证实存在严重的假阴性情况，表明扎伊尔型埃博拉病毒检测引物、探针亟需更新。本专利旨在建立一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，对过去的方法进行更新推广。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒具有特异性好、灵敏度高的优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括引物、TaqMan荧光探针和阳性标准品，其特征在于：

(1)所述的引物为扩增扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因的高度保守片段的一对引物，其中，

上游引物序列为：5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’(SEQ NO.1)，

下游引物序列为：5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’(SEQ NO.2)；

(2)所述的TaqMan荧光探针序列为：

5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ 3’(SEQ NO.3)；

(3)所述的阳性标准品为含有以下序列DNA片段的重组质粒：

TGGGACCGGACTGCTGTATCGAACCACATGATTGGACCAAGAACATAACAGACAAAATTGATCAGATTATTCATGATTTTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGGGGGACAATGACAATTGGTGGACAGGATGGAGACAATGGATACCGGCAGGTATTGGAGTTACAGG(SEQ NO.4)。

上述方案中，所述的阳性标准品由以下方法制得：

1)根据网络数据库GenBank上公布的扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因序列，利用Clustal_X软件进行序列同源性分析，然后以blastn网络工具比对分析其特异性，寻找所述编码基因中高度保守区域的氨基酸序列，再按常规方法合成出所述氨基酸序列的DNA片段；

2)将步骤(1)合成的DNA片段插入质粒载体pUC57(Amp⁺)中构建成重组质粒；

3)取5μl步骤(1)所得到的重组质粒与100μl DH5α感受态细胞混合后，冰浴20分钟；42℃水浴槽中热冲击70～90秒后，迅速冰浴5分钟；加入500μl LB肉汤培养基，混匀，37℃200rpm摇床培养1小时，得菌液；取100μl菌液在含浓度为100μg/μl的氨苄西林、浓度为20μg/μl的X-gal和浓度为200μg/μl的IPTG的LB培养基平板上进行涂布，培养18小时；然后通过蓝白斑筛选，挑取培养基上的白色菌株进行扩大培养；

4)取扩大培养后的白色菌株按Omega公司提供的质粒快速提取试剂盒的要求进行提取，然后用去离子水稀释至10⁶copies/μl即得阳性标准品。

本发明所述的试剂盒的使用方法如下：

(1)反应体系如表1所示：

表1本发明试剂盒PCR反应体系

(3)定量标准曲线制备：将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成10⁹～10³copies/μl 7个浓度梯度，按照步骤(1)和(2)所述的反应体系和反应程序进行扩增；

(4)样品检测：将阳性标准品、阴性对照和待检样品RNA按照上述反应体系进行配制和反应程序进行扩增后，从仪器配套软件中得到各个样品对应Ct值；

(5)结果判断：Ct值≤35.0为阳性，无数值或大于35.0为阴性。