[发明专利]一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法

权利要求书

1.一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取苦瓜种子1粒，去掉种皮后，用灭菌的刀片将其剖成4半，装入2mL圆头离心管，离心管内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻45s，采用高通量组织研磨器研磨破碎，参数设定频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；

(2)加入1.5mL试剂A，混匀后，置于65℃水浴锅中水浴45-60min，水浴期间每隔5min将离心管上下颠倒混匀1次；

(3)水浴后，用离心机离心10min；

(4)取上清，加入等体积的试剂B，上下颠倒混匀3-5min，离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇匀50次以上，然后用离心机在转速12000r/min下离心10min；

(5)按照上述步骤(4)重复操作1次；

(6)离心后，取上清，加入等体积试剂C进行抽提，轻轻摇晃15-20min，然后用离心机在转速12000r/min离心10min；

(7)按照上述步骤(6)重复操作1次；

(8)离心后，移液器轻轻地吸取上清夜至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的试剂D，离心管慢慢上下摇动30s，使试剂D与水层充分混合至能见到DNA絮状物，于4℃下沉淀30min；

(9)待沉淀结束后，用离心机在转速10000r/min下离心10min，弃上清，用无水乙醇清洗，在通风厨里晾干，用1×TE溶解，同时加入1.5μL RNA酶，再将其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜单粒种子DNA；

(10)将得到的苦瓜单粒种子DNA置于-20℃下保存，备用。

2.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(1)中苦瓜的品种为桂农科3号、桂农科6号或翠竹。

3.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的高通量组织研磨器的参数设定为：频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s。

4.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的试剂A在使用前提前预热至65℃。

5.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的试剂A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，质量浓度2％的CTAB、质量浓度1％的PVP-40和质量浓度0.5％的β-巯基乙醇，其余为蒸馏水；pH 8.0。

6.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的离心机的转速为12000r/min。

7.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述的试剂B包括：Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24：1)混合均匀，棕色瓶4℃保存。

8.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(6)中所述的试剂C包括：将氯仿和异戊醇按照体积比24：1混合均匀，棕色瓶4℃保存。

9.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(8)中所述的试剂D包括异丙醇和醋酸钠，二者的体积质量比为10:1。