[发明专利]一种检测人肾透明细胞癌细胞的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用

说明书

本发明公开了一种用于检测人肾透明细胞癌细胞（786‑O）的核酸适体其在制备检测制剂中的应用。同现有技术相比，本发明的核酸适体具有比相关蛋白抗体更高的亲和力与特异性；且无免疫原性，能够体外化学合成，分子量小。还可以对本发明的核酸适体的不同部位进行修饰和取代，同时序列稳定，便于保存；方便标记等优势。采用本发明的核酸适体进行人肾透明细胞癌细胞检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适体的合成成本较抗体制备成本低，周期短，重现性好。

技术领域

本发明涉及一种核酸适体及其应用，特别是涉及一种可用于人肾透明细胞癌细胞及临床样本组织检测的核酸适体及其在制备检测试剂的用途。

背景技术

肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，学术名词全称为肾细胞癌，又称肾腺癌，简称为肾癌，是最常见的肾脏实质恶性肿瘤。由于平均寿命延长和医学影像学的进步，肾癌的发病率比以前增加，临床上并无明显症状而在体检时偶然发现的肾癌日见增多，可达50%～70%。肾癌包括起源于泌尿小管不同部位的各种肾细胞癌亚型。

肾癌分为多种类型，其中透明细胞肾癌(conventional or clear cell renalcarcinoma) 为最常见的类型，占肾细胞癌的70%~80%。显微镜下肿瘤细胞体积较大，圆形或多边形，胞质丰富，透明或颗粒状，间质富有毛细血管和血窦。还有乳头状癌(papillarycarcinoma) 占肾细胞癌的10%~15%。包括嗜碱性细胞和嗜酸性细胞两个类型。肿瘤细胞立方或矮柱状，呈乳头状排列。乳头中轴间质内常见砂粒体和泡沫细胞，并可发生水肿。再而嫌色细胞癌(chromophobe renal carcinoma) 在肾细胞癌中约占5%。显微镜下细胞大小不一，胞质淡染或略嗜酸性，近细胞膜处胞质相对浓聚，核周常有空晕。此型肿瘤可能起源于集合小管上皮细胞，预后较好。

肾癌识别和治疗中存在着许多问题，比如缺乏早期识别或判断的症状；对放化疗不敏感，但免疫治疗有一定作用；目前已有一些针对抗血管生成的靶向治疗，但没有特异性针对肾癌细胞的靶向治疗。所以靶向肾癌细胞的适体筛选可能会提供了一种识别和治疗肾癌的有利分子工具，并对阐释调节肾癌的新分子机制以及发现新的分子探针和药物靶标提供新的思路，为研发检测和治疗肾癌的药物提供理论依据。因此，寻找出一种理想的标记物进而能够开发出快速、准确诊断以及治疗肾癌的方法就显得尤为重要。

核酸适体（nucleic acid aptamer)是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出来的能高亲和性结合靶分子的20-50碱基的寡聚核苷酸，包括DNA适体和RNA适体。适配体因其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点，同时，相比传统抗体，适配体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性。因此，适体在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景。利用这些适体对其所结合的细胞表面的靶分子进行表征和检测，有助于发现新的生物标志物。核酸适体已经被广泛应用于识别各种癌症靶标分子，发现新的生物标志物。

发明内容

本发明人建立了一个新的文库——Swan Library（参看plos one,2014, 9(1):e87002-e87002），我们将已发表的能够结合肿瘤细胞的核酸适体，进行同源性建模分析，设计出全新的核酸序列。本组所有筛选获得的这些序列明确，但功能不明确的核酸序列构成了Swan Library。Swan Library目前包含近100条ssDNA，且正在不断扩增。与普通的筛选文库相比的优点，我们的文库序列清晰无需高通量测序便能得到全新的的核酸适体。

我们将人肺癌细胞系（H1299），肝癌细胞系（HepG2)，人胰腺癌细胞系（PL45），人肾癌细胞系（786-O）以及其各自的对照细胞人支气管上皮细胞系（HBE)，人肝脏细胞系（HL7702），胰腺导管永生化细胞系（HPNE），人肾成纤维细胞系（KFB)与Swan Library中的所有ssDNA进行结合验证，进行近千次的结合验证实验后，最终得到一条与人肾癌细胞系（786-O）结合且不与人肾成纤维细胞系（KFB）结合的ssDNA，并将其命名为RCC-H1。