[发明专利]一种高效的黑木耳原生质体制备方法

权利要求书

1.一种高效的黑木耳原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制作固体PDA培养基：马铃薯200g煮汁后使用16层纱布过滤取汁，20g葡萄糖，20g琼脂粉，蒸馏水定容1L，使用121℃，0.1Mpa高压灭菌后，在无菌环境中每15mL倒入一个培养皿中，待其冷却凝固后，用封口膜封口备用；

（2）将黑木耳菌种在超净工作台中取0.5cm×0.5cm大小菌块放置于PDA固体培养基上，用封口膜密封后，放入25℃培养箱中培养15d；

（3）制备液体加富菌丝培养基：马铃薯200g煮汁过滤，加入葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾 3g，七水合硫酸镁2g，蒸馏水定容950mL，使用121℃，0.1Mpa高压灭菌，将10g甘氨酸用蒸馏水配置成甘氨酸溶液，在无菌环境下使用注射器通过0.22μm微孔滤膜将甘氨酸溶液过滤灭菌后，加入高压灭菌后的液体培养基中，定容为1L；

（4）在无菌环境中向长满菌丝的固体PDA培养皿中倒入10mL，刮取固体PDA培养基表面的菌丝，使用移液器将带有菌丝的液体培养基从培养皿中接入到50mL的液体培养基中，在25℃的恒温摇床中120rpm培养7d；

（5）高渗溶液及酶液配制：准确称取109.3g的甘露醇，用0.1mol/L的pH为5.8的磷酸缓冲液定容1L，使用115℃高压灭菌15min，冷却至室温后即是高渗缓冲液，称取购买自广东省微生物菌种保藏中心的lywallzyme溶壁酶0.4g，溶解于2mL甘露醇缓冲液后，无菌环境下使用注射器通过0.22μm微孔滤膜进行过滤灭菌后即配制为2%的酶液；

（6）使用6层无菌的纱布将在液体培养基中培养7d的菌丝进行过滤，弃去滤液，收集纱布上的菌丝，使用无菌滤纸吸干菌丝中的培养基，将收集的菌丝放入2mL的离心管中，使用离心机3000rpm离心3min，弃去上清保留沉淀，取0.75g的菌丝放入离心管中，按照菌丝：酶液=1:2（m:V）加入1.5mL的酶液，使用无菌研磨棒研磨五次后，漩涡混匀3min，使菌丝离散均匀，在30℃的气浴恒温摇床中，70rpm震荡酶解2h后，使用填装厚度为0.5mm脱脂棉的注射器过滤，将滤液3000rpm离心10min，弃去上清，加入0.6mol/L的甘露醇高渗溶液1mL，再次离心，弃去上清，加入0.6mol/L的甘露醇高渗溶液0.5mL，3000rpm离心10min，加入0.6mol/L的甘露醇高渗溶液0.5mL，轻柔的颠倒10-15次以重悬原生质体后，在显微镜下，使用血球计数板测量并计算原生质体数目。