[发明专利]一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的实时定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的实时定量PCR检测方法，其特征在于：在爆发前期和非爆发期对大型藻类孢子/配子数量进行监控和预测，包括以下步骤：

1)设计ITS区特异性引物：在长石莼、硬石莼和萱藻18S rDNA序列右端和ITS序列区域分别查找涵盖部分ITS区或ITS区全长的物种特异性引物；分别选取序列相似性高于90％的同属或同科物种作为参考，进行特异性位点查找；使用Intergrated DNATechnologies网站对所得特异性引物的GC含量，Tm值，引物二聚体形成，发卡结构产生等参数进行在线评估，筛选得出高质量引物对；

长石莼引物序列为ACACCCCTGCGATAGTAACT和GACCGAGCCACCGCCTAGA，

硬石莼引物序列为GGTTCGCCCCGCCGTAGT和TCGGGCCCACAGCACGCGAG，

萱藻引物序列为GAACTAGGCCCCCAGTGTCATAT和GTCAACAACTCTGTGCGCAA；

2)引物特异性验证：利用NCBI的BLASTn功能和Primer-BLAST在线软件对步骤1)中所得引物的特异性进行验证；以实验室对照藻类和养殖水样DNA为模板，扩增其ITS序列，验证引物特异性和普适性；

3)定量PCR条件优化：利用包含目标片段的标准线性DNA构建标准曲线，回归系数达到0.98以上，扩增效率为大于90％；

4)定量PCR法实时监测海参养殖水体大型藻类孢子/配子的数量。

2.按权利要求1所述的实时定量PCR检测方法，其特征在于：步骤2)扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性60s，55～57℃退火45s，72℃延伸60s，循环30～35次；72℃延伸10min。

3.按权利要求1所述的实时定量PCR检测方法，其特征在于：所述养殖水样DNA的获取是将不同时期采集的养殖水样经200μm孔径的筛绢预过滤后，缓慢抽滤到0.22μm孔径的醋酸纤维素膜上提取DNA。

4.按权利要求1所述的实时定量PCR检测方法，其特征在于：定量PCR标准曲线的构建是将含有藻类ITS片段的标准DNA按1:10²～1:10⁸倍比稀释，进行定量PCR实验，根据所得结果中的临界循环值CT绘制参考标准曲线；使用微量紫外分光光度计测量不同稀释倍数下质粒的DNA浓度，并利用公式：copies/μL＝(6.02×10²³×(DNA浓度×10^-9))/(DNA长度×660)计算标准DNA中ITS拷贝数；标准曲线以质粒DNA中ITS的拷贝数的log₁₀为横坐标，CT值为纵坐标进行绘制；qPCR实验的扩增效率根据质粒标准曲线斜率k计算，计算公式为：E＝(10^-1/k－1)×100％；DNA浓度的单位是ng/μL。

5.按权利要求1的实时定量PCR检测方法，其特征在于：所述的定量PCR条件优化扩增程序为：95℃预变性7min；95℃变性30s，56～58℃退火30s，72℃延伸45s，72～80℃采集信号，40个循环。样品扩增产物溶解曲线显示单峰，且扩增产物的凝胶电泳检测为目标单一条带。