[发明专利]血管生成素富集的乳级分

说明书

本申请是2009年5月14日提交的申请号为PCT/AU2009/000604、发明名称为“血管生成素富集的乳级分”的国际申请的分案申请，所述国际申请于2011年1月13日进入中国国家阶段，其申请号为200980127436.4。

本发明涉及用于从乳样品中获得血管生成素富集产品的方法，以及这一产品作为食品添加剂、营养品、医药或兽药产品或者用于制备治疗性组合物的应用。

背景技术

血管生成素是一种14kDa的非糖基化多肽，其由数种生长细胞类型产生，例如血管内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、成纤维细胞以及某些肿瘤如结肠癌、卵巢癌和乳腺癌。血管生成素已从多种来源分离，包括正常人血浆、牛血浆、牛乳以及小鼠、兔和猪血清。血管生成素在这每一种来源中均以低水平存在(在牛乳中小于12mg/L，在人血浆中小于150μL/L)。

除了作为血管生成的强效刺激素以外，血管生成素还被证明具有多种其他活性。这些活性包括除去皮肤缺陷例如色素斑的能力、调节免疫反应、保护多形核白细胞免于自发降解和抗系统性细菌和真菌病原体的杀微生物活性。基于该蛋白的已知生理功能，可预测血管生成素在医药、饮食食品添加剂和化妆品中的多种用途。

血管生成素在这些用途中的应用需要一种以商业规模从合适来源制备该蛋白的有效方法。提供这一方法是本发明一个优选实施方案的目标。

发明内容

虽然牛乳是一种高度丰富的商品时，但其用作血管生成素来源并不有利，因为血管生成素仅以低水平存在于牛乳中，而且乳中存在的某些蛋白(例如免疫球蛋白、乳铁蛋白和乳酸过氧化物酶)掩盖血管生成素并阻碍其纯化。发明人已发现数种富集乳级分的血管生成素的方法，如下面第一至第五方面和本发明人以WO2008/055310公布的申请中所述，所述每种方法均能够从乳中生产血管生成素富集产品。

本发明的第一方面提供一种从乳样品中获得血管生成素富集产品的方法，所述方法包括：

(a)将所述乳样品与一种与血管生成素相互作用的捕获剂接触，从而使所述乳样品中存在的血管生成素与所述捕获剂相互作用形成一种血管生成素-捕获剂复合物；

(b)将所述复合物从所述乳样品中分离出来；

(c)将血管生成素从所述复合物的捕获剂中释放出来；和

(d)收集步骤(c)的血管生成素，从而获得血管生成素富集产品。在

一个实施方案中，所述捕获剂固定于一种支持物。

在另一个实施方案中，所述捕获剂是一种抗体。

本发明的第二方面提供一种从乳样品中获得血管生成素富集产品的方法，所述方法包括：

(a)将所述乳样品加至其上面固定有与血管生成素相互作用的抗体的支持物，其中所述乳样品中存在的血管生成素与所述支持物上的抗体相互作用形成一种血管生成素-抗体复合物；

(b)从所述支持物上洗去所述乳样品中存在的不与所述抗体相互作用的组分以将所述复合物从所述乳样品中分离出来；

(c)将血管生成素从所述复合物的抗体中释放出来；和

(d)收集步骤(c)的血管生成素，从而获得血管生成素富集产品。

在第一方面或第二方面的一个实施方案中，所述方法涉及免疫亲和色谱法。

第三方面提供一种从乳样品中获得血管生成素富集产品的方法，所述方法包括：

(a)将液相乳样品加至第二相，所述第二相使得可基于所述乳样品组分的尺寸分离组分；和

(b)收集与所述乳样品的其他组分分离的血管生成素，从而获得血管生成素富集产品，其中在步骤(a)之前，不对所述乳样品进行凝乳或酸沉淀处理，或者所述乳样品不是乳清或乳清级分。

在第三方面的一个实施方案中，所述第二相为半渗透相。

在第三方面的其他实施方案中，所述半渗透相允许尺寸小于20kDa、甚至尺寸小于50kDa的组分作为渗透物通过所述半渗透相。在一个优选实施方案中，所述半渗透相允许尺寸小于30kDa的组分作为渗透物通过所述半渗透相。在这些实施方案中，血管生成素作为渗透物通过所述半渗透相。

在第三方面的又一实施方案中，所述半渗透相允许尺寸小于10kDa的组分作为渗透物通过所述半渗透相。在这一方案中，血管生成素作为保留物为所述半渗透相所保留。

在第三方面的另一实施方案中，迫使所述乳样品通过所述半渗透相。

在第三方面的一个实施方案中，借助于由注射器、压缩气体、泵、离心力或其组合施加的力迫使所述乳样品通过所述半渗透相。