[发明专利]一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物疫苗制备技术领域，具体涉及一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

传染性造血器官坏死症（Infectious Hematopoietic Nec-rosis，IHN）是由传染性造血器官坏死病毒（Infectious Hematopoietic Nec-rosis Virus，IHNV）感染引起的鲑鳟鱼类的一种严重的急性、传染性病毒病，该病毒属于弹状病毒科诺拉弹状病毒属，基因组为不分节段的单股负链RNA病毒。根据鱼的种类、年龄、病毒株系以及环境条件的不同，IHN的爆发可能导致鱼体80%～100%的死亡率，对世界鲑鱼养殖业造成了重大损失。目前已成为制约鲑鱼养殖发展的重要威胁，由于其发病急、发病率高，已被国际兽医局OIE列为必须申报的疾病，被我国列为二类疫病。

对健康的鱼体进行早期免疫接种是预防病毒病的常用方法。疫苗接种可以刺激鱼类免疫系统产生特异性免疫反应，增强鱼体抗病力，从而降低疾病的发生率。目前为了控制IHNV已经研制出2种类型的疫苗，即灭活疫苗、减毒疫苗。但由于病毒在体外扩繁效率较低，灭活疫苗生产成本昂贵，以及灭活不彻底而造成散毒的潜在危险等因素的存在，限制了其的广泛使用。因此，研制安全、高效的新型传染性造血器官坏死症分子疫苗显得非常必要。

活载体疫苗是近年来研究的热点之一，被认为是一种很有开发前景的疫苗。制苗时往活载体中插入外源保护性目的基因，由于外源基因已经成为作为载体的病毒或细菌的自身结构的一部分，故所产生的免疫应答水平通常不低于完整病毒或细菌相应成分所引起的免疫强度。重组腺病毒载体具有宿主范围广，对外界有一定的抵抗力，被认为是基因工程疫苗的优良载体。复制缺陷型腺病毒常缺失对于病毒复制所必需的病毒早期基因E1区，使其在体内不能复制，因此研制重组复制缺陷型腺病毒传染性造血器官坏死症疫苗更为安全和有效。

传染性造血器官坏死症病毒有6种结构蛋白，其中糖蛋白G与病毒的感染和免疫有密切关系。Anderson et al首次报道了IHNV DNA疫苗的应用，通过使用含有IHNV G蛋白基因的质粒免疫虹鳟鱼可以诱导虹鳟鱼产生针对IHNV的保护性免疫。2005年7月，IHNV的DNA疫苗CMV启动子操纵IHNV G蛋白基因的表达，已在加拿大被批准商品化。活载体疫苗具有安全、高效、生产费用低廉等优点，但目前尚未有传染性造血器官坏死症活载体疫苗上市。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种利用腺病毒载体表达传染性造血器官坏死症传染性造血器官坏死症病毒G蛋白制备传染性造血器官坏死症活载体疫苗的方法，获得了安全、高效的传染性造血器官坏死症传染性造血器官坏死症疫苗。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，将传染性造血器官坏死症病毒抗原蛋白G基因插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体的特异性启动子和终止子之间，构建得到含有G基因的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体，再将重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体通过同源重组得到重组腺病毒质粒，用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，即得到防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗。

进一步的，上述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，所述传染性造血器官坏死症病毒抗原蛋白G基因是通过PCR方法扩增出的，扩增引物序列分别为SEQ ID No.1（GF）和SEQ ID No.2（GR）。

SEQ ID No.1（GF）：5’GCAGATCTGCCACCgccaccatgtacaccatg 3’ （含有BglⅡ酶切位点）；

SEQ ID No.2（GR）：5’ GCGTCGttaggaccggtttgccagg 3’ （含有SalⅠ酶切位点）。

进一步的，上述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，所述重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体的构建过程中，腺病毒载体启动子为CMV，终止子为PolyA；

构建过程具体包括以下步骤：

1）将扩增得到的目的基因G经BglⅡ、SalⅠ双酶切，形成带有粘性末端的目的基因片段；

2）同时，将腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV经BglⅡ、SalⅠ双酶切，得到线性化的载体；

3）使用T4 DNA连接酶对步骤1）和2）的产物进行粘端连接；