[发明专利]一种固定化双酶耦合反应生产非天然氨基酸产品的工艺

说明书

本专利公开了一种固定化双酶耦合反应生产非天然氨基酸产品的工艺。以聚乙烯醇、海藻酸钠和卡拉胶为固定化材料，以硼酸‑硼砂‑氯化钙‑碳酸钠体系为交联剂，将具有酰化消旋酶和氨基酰化酶活性的两种基因工程菌按照一定比例混合后共固定化，制备出颗粒状固定化细胞。以乙酰化‑DL‑氨基酸为原料，在生物反应器中双酶耦合反应，高效生产非天然氨基酸系列产品。

技术领域

本发明涉及一种固定化双酶耦合反应生产非天然氨基酸产品的工艺，属于生物化学中的酶工程技术领域。

背景技术

非天然氨基酸，是众多药物尤其是近十年来众多新药的核心中间体，如左乙拉西坦使用L-2-氨基丁酸，培哚普利使用L-正缬氨酸，氯吡格雷使用L-2-邻氯苯甘氨酸，他塔那非使用D-色氨酸，佐米曲坦使用D-脯氨酸，阿扎那韦、特拉匹韦使用L-2-叔亮氨酸，那格列奈、奥曲肽使用D-苯丙氨酸等。

非天然氨基酸主要的生产手段是利用生物酶技术，利用的酶有氨基酰化酶、青霉素酰化酶、海因酶，脱氢酶，氨基酸氧化酶等。其中氨基酰化酶是主要的方法之一，长期以来用于生产非天然氨基酸。氨基酰化酶有D-氨基酰化酶和L-氨基酰化酶，其中D-氨基酰化酶催化乙酰-D-氨基酸生成D-氨基酸，L-氨基酰化酶催化乙酰-L-氨基酸生成L-氨基酸。在工业上，氨基酰化酶法生产非天然氨基酸的原料为乙酰化-DL-氨基酸，因此转化率只有50%。

专利报道了将酰化消旋酶与氨基酰化酶混合后偶联反应，将DL-乙酰化-DL-氨基酸一步转换为手性氨基酸，转化率达到了100%。该方法的缺点是使用游离细胞法，不便于重复使用，游离细胞容易破碎，产品成本高，产品质量不稳定；如何能够将生物催化剂重复使用、降低催化剂成本是该技术能否工业应用的关键因素，其中固定化酶或者固定化细胞技术是主要的解决途径。

固定化细胞技术作为生物工程新技术，具有成本低、污染小、效率高等优点。目前固定化技术使用的材料有卡拉胶、海藻酸钠、树脂、葡聚糖、聚丙烯酰胺等，固定化细胞材料用于产业化，理论上要求具有以下特点：容易与细胞或者酶快速混合，并快速凝固；尽量低温凝固，以避免酶的活性损失；尽量为颗粒状，便于装入反应器，以及获得较好的反应特性；具有较好的强度硬度等机械性能；具有多孔性，具有良好的传质性能；价格低廉。为了制备具有以上性能的固定化细胞，研究人员通过优化固定化材料和制备工艺、选择优质的交联剂等方式已经推出各类性能不同的固定化细胞。

聚乙烯醇作为一种新型的生物催化剂包埋固定化载体，具有强度 高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、价格低廉等优点，但仍存在以下缺点：1.用于交联聚乙烯醇的溶液酸性较强，会使固定化细胞活性降低；2.具有高粘性，并且与酸反应较慢，会使滴入时间相差不大的两液滴粘连，并附聚成团，不易凝胶成球；3.固定化后酶活保留率低，部分对酸敏感的酶会逐渐失活。

因此研究一种好的复配交联剂体系，已经成为聚乙烯醇为固定化材料酶法生产非天然氨基酸的重要影响因素。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供了一种固定化双酶耦合一步法反应生产非天然氨基酸产品的工艺。

其特征在于：以聚乙烯醇、海藻酸钠、卡拉胶的混合物为固定化材料，以硼酸-硼砂-氯化钙-碳酸钠体系为交联剂，将具有氨基酰化酶和酰化消旋酶的基因工程菌混合后共固定化，制备出颗粒状固定化细胞。以乙酰化-DL-氨基酸为原料，在生物反应器中利用双酶耦合反应，一步生产非天然氨基酸系列产品。具体操作工艺如下：

交联剂溶液的配制工艺：

在搅拌容器中加入水，加入一定比例的硼酸，硼砂、氯化钙，碳酸钠，调整pH即得到交联剂溶液。可以根据要求增减部分原料和配比。

细胞共固定化工艺：