[发明专利]用于多重PCR的引物组合物

说明书

本发明涉及一种用于多重PCR的引物组合物，该引物组合物由一对以上引物对组成，其中各引物包括5’端的形成发夹结构的序列和3’端的特异性引物序列。本发明还涉及一种多重PCR法，包括使用上述引物组合物对DNA样本进行多重PCR扩增，其中在PCR中采用具有双链5’‑3’外切活性的DNA聚合酶。采用本发明的用于多重PCR的引物组合物进行扩增，可以有效避免引物二聚体的形成，减少非特异性的扩增。因而，可以在PCR扩增中同时使用多达上百甚至上千对的引物对，并得到特异性扩增的条带，且扩增覆盖率例如达98％以上，扩增均一性例如达到95％以上。

技术领域

本发明涉及一种用于多重PCR的引物组合物、包含该引物组合物的靶向测序用引物组合物、以及分别使用这两种引物组合物进行多重PCR扩增和靶向测序的方法。

背景技术

目标序列捕获测序，是一种针对已知的特定基因组区域进行测序的技术。采用目标序列捕获测序，例如外显子组捕获测序，使得研究人员能够将研究重点放在人类基因组的重要组成部分上。从而，在相同的时间和成本下，能够研究更多的样本，而样本数量是发现致病基因的关键指标，样本量越多，定位到疾病相关基因的可能性越大。

对于一些稀有的变异或者部分体细胞的基因突变，靶向测序是一种比较有效的工具。例如，DMD基因的突变是引起杜氏进行性肌营养不良病的原因，对于该疾病的探讨，非常适合采用靶向测序。

另外，对于一些遗传疾病，其在表型上与其他疾病非常相似，有可能是由目前已知基因变异中的一种而引起的。对于这类疾病的研究，可以把可能相关的变异区域并在一起，对目标序列进行测序。

目标序列捕获测序可以分为两种方式。一种是目标片段的PCR目标序列捕获。另一种则由核酸分子碱基互补原理发展而来，根据目标基因组序列设计与之完全互补的探针，使打断的基因组DNA与探针杂交，从而用捕获的DNA片段直接建库，进行DNA测序。

在上述的目标序列捕获测序方式中，使用多重PCR的目标序列捕获技术遇到了技术瓶颈。目前，该技术中的多重PCR一般仅能做到使用几到几十对引物进行扩增，对于更多对引物的扩增，很难实现较好的效果，许多片段不能被充分扩增。究其原因，主要在于，当引物对数多到一定程度时，PCR引物间的相互干扰以及非特异性扩增急剧上升，进而会扩增出非常多的非靶区条带，导致无法有效地扩增及分析目标片段。

发明内容

鉴于现有技术中的上述状况，本发明意在提供一种能够有效地提升多重PCR扩增效果的引物组合物、包含该引物组合物的靶向测序引物组合物、以及分别使用这两种组合物进行多重PCR和靶向测序的方法。

一方面，本发明涉及一种用于多重PCR的引物组合物，该引物组合物由一对以上引物对组成，其中各引物包括5’端的形成发夹(hairpin)结构的序列和3’端的特异性引物序列。

在一个实施方式中，各引物由5’端的形成发夹(hairpin)结构的序列和3’端的特异性引物序列构成。

在一个实施方式中，各引物对包括正向引物和反向引物，正向引物中形成发夹结构的序列不同于反向引物中形成发夹结构的序列。

在一个实施方式中，在引物组合物中，各正向引物中形成发夹结构的序列均相同，各反向引物中形成发夹结构的序列均相同。

在一个实施方式中，各引物中形成的发夹结构包括基本互补或完全互补的15-25对碱基对，且包括由1-6个核苷酸形成的回折区。

在一个实施方式中，各引物中形成发夹结构的序列的GC含量在40-70％之间。