[发明专利]用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒及其检测方法，能够用于痛风易患性风险的辅助评估。

背景技术

SLC2A9基因位于人常染色体4p15.3-16，包括12个外显子和11个内含子，长195kb，编码由540个氨基酸组成的葡糖糖转运蛋白，参与维持体内葡糖糖代谢的相对稳定和平衡，也有多个研究发现该蛋白与尿酸代谢也密切相关。SLC2A9是一种高亲和力、高容量、电压敏感性和pH依赖性的尿酸盐/己糖转运体，在肾脏主要发挥对尿酸的重吸收作用，基因功能丧失将导致特发性肾性低尿酸血症。欧洲、美国、日本、非洲等多个人群的血尿酸水平与SLC2A9基因的SNP有关。研究发现汉族人群中SLC2A9 SNP rs3775948与尿酸水平显著相关(p＝0.071)。

痛风(Gout)和高血酸尿症(Hyperuricemia，HUA)是人体内嘌呤代谢紊乱引起的代谢性疾病，当HUA患者出现痛风性关节炎、关节内尿酸盐结石和痛风性肾病将其称之为痛风，仅有约10％的HUA可能发展为痛风。痛风发病率呈逐年上升趋势，中国沿海及经济发达地区汉族人群中痛风发病率已达2％，而且大量流行病学调查研究发现痛风是高血压、心血管疾病和肾脏疾病的独立风险因素，所以痛风现已成为威胁人类健康的常见疾病之一。痛风发病率呈逐年上升趋势，中国沿海及经济发达地区汉族人群中痛风发病率已达2％，其中男性的发病率约为女性的18倍，发病年龄也早于女性。痛风作为一种复杂的多基因遗传病，饮食和遗传因素是其发病的主要致病因素，但其具体的发病机制目前尚不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒及其检测方法。该检测方法具有灵敏度高，准确度高，方法简单，成本低的有点，有利于临床使用和推广。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种用于检测SLC2A9基因SNP位点rs3775948基因型的试剂盒，包括以下组分：

(1)SLC2A9 rs3775948标准品；

(2)引物，包括具有SEQ ID NO.1的上游引物序列和具有SEQ ID NO.2的下游引物序列；

(3)含饱和荧光染料Eva Green的PCR扩增试剂。

作为本发明的优选方案，所述SLC2A9 rs3775948标准品按照下述方法制备，具体包括如下步骤：

(1)重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs3775948的构建和转化：合成具有SEQ ID NO.3的SLC2A9 rs3775948野生型DNA序列和具有SEQ ID NO.4的SLC2A9 rs3775948纯合突变型DNA序列；

(2)连接反应：将步骤(1)合成的DNA片段与pMD18-T进行连接，采用连接体系进行配制，配制完成后置于16℃进行过夜连接反应；连接体系如下：

(3)pMD18-T-rs3775948质粒的转化以及PCR鉴定；

(4)pMD18-T-rs3775948质粒的获取和定量。

作为本发明试剂盒的优选方案，所述步骤(3)pMD18-T-rs3775948质粒的转化以及PCR鉴定具体包括如下步骤：

(3.1)从-80℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其解冻；

(3.2)取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；

(3.3)42℃水浴热激90秒，热激后立即置冰上冷却2min；

(3.4)于1.5ml EP管中加入预冷的1ml的不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，37℃120转轻摇培养90min；

(3.5)将上述培养液短暂离心吸去900ul后取剩余的100ul涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；

(3.6)从平板上挑取单克隆菌落于500μL Amp抗性LB液体培养基的1.5ml EP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时；

(3.7)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；