[发明专利]一种产2‑MIB蓝藻的探针杂交快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产2-MIB蓝藻的探针杂交快速检测方法。

技术背景

近年来，随着水体富营养化的日益加重，蓝藻水华在全球尤其是我国大面积爆发。水华问题已经成为我国环境保护领域所面临的重大问题。很多蓝藻会分泌具有异味的挥发性次生代谢产物，使水体和水产品产生令人反感的嗅味。水体异味问题不仅大大降低了饮用水的水质，还对渔业、生态景观和旅游业等造成了巨大的损失。2-MIB（2-甲基异莰醇）是一种具有强烈气味的有机化合物，是饮用水嗅味问题存在的主要物质。作为富营养化水体中重要的生物类群，蓝藻通常被认为2-MIB合成和释放的主要生物类群。

纳米金即指金的微小颗粒，其直径在1～100nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。柠檬酸钠还原氯金酸制备的纳米金溶液中，纳米金颗粒能均匀的分散在溶液中，并呈现出红色。在一定浓度的盐作用下，纳米金颗粒能快速聚合导致颜色变化，随便盐浓度的增加，颜色变紫至无色。探针是一种短链DNA，能吸附在纳米金颗粒表面从而避免盐诱导纳米金聚合。而探针能与PCR扩增产物特异性结合。目前，纳米金被广泛用于生物标记和检测，但用于对产2-MIB蓝藻的检测尚未见报道。

传统的分子生物技术在对2-MIB合成基因进行扩增后需要进行凝胶电泳进行定性分析，这无疑增加了检测成本，且电泳时通常使用的EB染剂有致癌性。探针杂交法则在扩增后与探针进行杂交再加入纳米金与盐溶液即可通过肉眼观察进行定性检测，杂交显色反应在10min内即可完成。本方法所需成本低，较传统方法耗时短，且减少了电泳过程带来的健康风险，对水质监测具有重大的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产2-MIB蓝藻的探针杂交快速检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种产2-MIB蓝藻的探针杂交快速检测方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 提取含藻水样中藻类的总基因组DNA，并溶于无菌双蒸水保存；

b. 将步骤a所提取到的DNA进行PCR扩增反应，每50μL反应体系中含有：

Premix EX Taq酶 25μL，

10μmol/L的特异性扩增2-MIB 合成相关单萜环化酶基因的正反引物各 0.5μL，

待检测的DNA 1μL，

双蒸水23μL ，

所述的特异性扩增2-MIB 合成相关单萜环化酶基因的正反引物为：

FIP 5’-CGCATAGGCACCCCAAGAGACGCAAGTCCAGCGCACCT-3’；

BIP 5’-TTGGAAGTATCTAGCCGCGCG-GGGTCGATTAGCGTCATG3’；

反应程序为：94℃预变性3min，接着40个循环，每个循环94℃ 30s、58℃ 30s 和72℃ 30s，循环过后最后72℃延伸5min；

c. 将步骤b所得PCR扩增产物与特异性探针经高温变性后杂交，探针序列为：F3 5’-TGGGCCAGTACGCCAC-3’、B3 5’-GGAGGACGTACCCTCCAATG-3’，杂交反应程序为：94℃ 5min，50℃ 3min；所述的PCR扩增产物与特异性探针溶液的体积比为4：1～10：1； 所述的探针溶液的浓度是10μmol/L；

d. 在步骤c所得杂交反应混合物中加入纳米金溶液和盐溶液进行显色反应；所述的杂交反应混合物与纳米金溶液和盐溶液的体积比为： 1：6：3 ；所述的盐溶液的浓度为： 20mmol/L～50mmol/L；所述的纳米金溶液，是由柠檬酸三钠还原1%氯金酸制备而成，纳米金的粒径为13～25nm。

所述的盐溶液为：磷酸缓冲盐溶液PBS、氯化钠溶液、氯化钙溶液或氯化镁溶液。

所述的步骤d中的显色反应采用紫外分光光度计，测定吸光度值范围为450～650nm之间。

传统的分子生物方法对2-MIB合成基因进行扩增后需要进行凝胶电泳进行定性分析，本方法在扩增后与探针进行杂交再加入纳米金与盐溶液即可通过肉眼观察进行定性检测，杂交显色在10min内即可完成，总检测时长不超过2小时。方法简单易行，所需成本低，无需贵重仪器，节约了时间，且减少了电泳过程带来的健康风险。

附图说明

图1为2-MIB合成基因的PCR产物与探针杂交反应后颜色对比；

图2为2-MIB合成基因的PCR产物与探针杂交反应后吸光度的对比，以不含2-MIB合成基因的扩增产物为阴性对照。