[发明专利]一种复制缺陷型人14型腺病毒载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种复制缺陷型人14型腺病毒载体，其特征在于，由如下方法制备得到：将Ad14基因组质粒化，敲除其E3和E1基因，进而将其E4基因开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框。

2.根据权利要求1所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体，其特征在于，还在Ad14的E1基因区域整合外源基因表达框。

3.权利要求1或2所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

S1.PCR扩增获得Ad14基因组的左右两端，连接至氨苄抗性质粒得到pT-Ad14(L+R)，线性化后与Ad14基因组重组，得到基因组质粒pAd14；

S2.PCR扩增获得Ad14 E3基因的左右臂并反向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与部分酶切线性化的pAd14同源重组，得到去除E3基因的基因组质粒pAd14ΔE3-Kana；

S3.PCR扩增Ad14 E3基因的左右臂并同向连接到卡那霉素抗性质粒上，线性化后与线性化的pAd14ΔE3-Kana进行重组，得到去除卡那抗性基因的基因组质粒pAd14ΔE3；

S4.PCR扩增Ad14 E1基因的左右臂并反向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与部分酶切线性化的pAd14ΔE3同源重组，得到去除E1基因的基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3-Kana；

S5.PCR扩增Ad14 E1基因的左右臂并同向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与线性化的pAd14ΔE1ΔE3-Kana进行重组，得到去除卡那抗性基因的基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3；

S6.PCR扩增Ad14 E4基因连接至氨苄抗性质粒得到p14E4，PCR扩增得到Ad5基因组E4开放阅读框2、3、4、6和6/7，取代Ad14 E4基因中相应区域得到p14E4(5E4)，线性化后与线性化的pAd14ΔE1ΔE3同源重组，得到敲除E1、E3并改换E4的基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3(5E4)。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的具体方法为：以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到Ad14基因组左右两端L-Ad14和R-Ad14作为重组臂连接到线性化的T载体上，得到pT-Ad14(L+R)，同时在pT-Ad14(L+R)的左右臂之间引入了EcoRI、BamHI作为酶切位点，EcoRI+BamHI双酶切pT-Ad14(L+R)线性化后与Ad14基因组重组，得到pAd14。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的具体方法为：以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到E3基因同源重组臂L-ΔE3及R-ΔE3，反向连接至pVax载体得到pVax-ΔE3(L+R)，线性化后，与经EcoRI部分酶切线性化的pAd14同源重组，经氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选得到敲除E3基因同时在E3基因区引入唯一的线性化酶切位点swaI的质粒pAd14ΔE3-Kana。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的具体方法为：以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到E3基因同源重组臂L-ΔK(E3)及R-ΔK(E3)，正向连接至pVax载体得到pVax-ΔK(E3)，线性化后与经SwaI线性化的pAd14ΔE3-Kana进行重组，得到敲除E3和卡那抗性基因，同时引入Swal单酶切位点的pAd14ΔE3；所述步骤S4的具体方法为：根据步骤S2相同的原理，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-ΔE1及R-ΔE1，反向连接至pVax载体得到pVax-ΔE1(L+R)，线性化后与PacI酶切线性化的pAd14ΔE3同源重组，经氨苄、卡那霉素双抗性筛选得到敲除E1基因并在E1基因区引入唯一的线性化酶切位点PmeI的质粒pAd14ΔE1ΔE3-Kana。