[发明专利]一种从胸水中提取cfDNA的方法、试剂盒以及构建的cfDNA文库

权利要求书

1.一种从胸水中提取cfDNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

第1步，对胸水样本进行离心分离；

第2步，在第1步得到的上清中加入Carrier RNA、蛋白酶K、裂解液，进行孵育处理，再加入DNA析出液；

第3步，将第2步得到的样品采用柱吸附的方式对cfDNA进行吸附，再经过解吸之后，获取到cfDNA；

所述的裂解液中包含有100 mmol Tris-HCl、25 mmol EDTA、500 mmol NaCl、1% SDS；

所述的DNA析出液中包含有0.15 mol/L NaCl、0.02～0.05 M 磷酸盐溶液；

柱吸附中采用的是硅胶膜吸附柱；

在进行解吸之前，依次采用盐洗涤溶液和醇洗涤溶液对吸附柱进行冲洗；

所述的盐洗涤溶液中包括有：10～20 mM 三羟甲基氨基甲烷；1～5 M 盐酸胍、10～30mM EDTA-2Na、0.1～1% HCl；

所述的醇洗涤溶液是由75～80vol.%的乙醇和异丙醇1:1配制；

所述的Carrier RNA的加入量是是每毫升胸水样本中加入5～50μl，蛋白酶K的加入量是每毫升胸水样本中加入50～500μl，裂解液的加入量是每毫升胸水样本中加入0.5～5ml，DNA析出液的加入量是每毫升胸水样本中加入0.5～5ml；

盐洗涤溶液的用量是每毫升胸水样本对应30～100μl；

醇洗涤溶液的用量是每毫升胸水样本对应150～300μl；

解吸所采用的解吸液是无酶水；

2.一种从胸水中提取cfDNA的试剂盒，其特征在于，包括有：裂解液、DNA析出液、蛋白酶K、Carrier RNA、吸附柱、盐洗涤溶液、醇洗涤溶液、解吸液；裂解液、DNA析出液、蛋白酶K、Carrier RNA、盐洗涤溶液、醇洗涤溶液的体积比范围是：500～5000：500～5000：50～500：5～50：30～100：150～300；所述的解析液是无酶水；

所述的裂解液中包含有100 mmol Tris-HCl、25 mmol EDTA、500 mmol NaCl、1% SDS；

所述的DNA析出液中包含有0.15 mol/L NaCl、0.02～0.05 M 磷酸盐溶液；

柱吸附中采用的是硅胶膜吸附柱；

所述的盐洗涤溶液中包括有：10～20 mM 三羟甲基氨基甲烷；1～5 M 盐酸胍、10～30mM EDTA-2Na、0.1～1% HCl；

所述的醇洗涤溶液是由75～80vol.%的乙醇和异丙醇1:1配制。

3.一种cfDNA文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

第1步，对权利要求1所述的从胸水中提取cfDNA的方法得到的cfDNA进行大小片段分离；

第2步，对小片断cfDNA依次进行末端修复、3'末端加上碱基A、两端加上接头、纯化，得到cfDNA文库；所述的第1步中的大小片段分离是采用磁珠法分离。

4.cfDNA文库在基因测序中的应用；所述的cfDNA文库是指通过权利要求3所述的cfDNA文库的构建方法得到的；所述的基因测序是采用NGS方法；所述的基因是EGFR基因或者ALK基因；所述的应用，是指NGS基因突变敏感性检测。