[发明专利]一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法

说明书

本发明属于分子遗传生物学及发育生物学领域，公开了一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，所述以慢病毒为工具的在体基因沉默方法包括：利用微量进样器注射病毒；2天鸡胚，在气室打洞，目视确定气室膜位置，将进样器插入气室正中膜下，将病毒注入。本发明建立了以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，并成功建立了PPARalpha在体沉默鸡胚模型。本发明的方法较为简便，目视下即可完成操作，成本低，实用性强，成活率可达80％，在心脏转染效率高，在体沉默效率可达70％左右。在体转染完整保留了复杂的发育信号转导过程，可作为研究目标基因在发育中所发挥作用的有力工具。

技术领域

本发明属于分子遗传生物学及发育生物学领域，尤其涉及一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法。

背景技术

基因操作是研究特定基因在生命活动中所起作用的必须方法，经典的方法是基因敲除(Knock out)，其能有效去除目标基因，但相对成本高昂且耗时较长，同时，由于其对生物基因组的改变，可能带来一些未知的副作用，降低研究的可靠性。

siRNA是近年来发现的一种能特异性识别并抑制、降解特定mRNA，从而在不改变DNA的前提下降低目标基因蛋白表达水平的小分子RNA，其已被广泛应用于沉默目的基因以研究其在特定生物活动中所起的作用。常见的将siRNA导入细胞的方法有电穿孔法，脂质体法及病毒法等。其中病毒法具有持续时间长，效率高等优点，但是，一般以慢病毒介导的siRNA基因沉默均以离体细胞为目标，病毒需要直接接触宿主细胞来达到转染效果，如果注射于整体动物，则由于能应用的病毒量的限制，只能局部转染少量组织，且不能达到均匀转染，方法的应用价值不大。

离体细胞是经典的研究工具，但其有一定的局限性，只由一种或数种细胞组成，没有真正的生物体内复杂的微环境，神经体液调控等等，因此不能满足复杂的在体机制研究需要，特别是像发育这样需要多种细胞在复杂的信号通路下共同进行的过程，无法以离体细胞模型模拟，因此目前的发育研究很难应用慢病毒沉默技术，而多用传统的基因敲除法。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有在整体生物中的基因操作方法成本高昂而耗时较长，容易引起未知的副作用，而慢病毒介导的siRNA沉默又基本上只用于离体细胞模型，不能满足复杂的整体机制研究需要，需要开发一种能以现有的慢病毒介导，在整体生物中起基因沉默作用的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法。

本发明是这样实现的，如果应用成年动物为模型，有限的慢病毒注射不可能有效地转染全身的大量细胞，而应用鸡胚则可克服这一问题，在鸡胚发育的早期，整个鸡胚的细胞数量并不多，只要将适量慢病毒在适当的时间点注入鸡胚，将足以转染绝大部分鸡胚细胞，同时由于慢病毒的特点，siRNA的表达将永久性地随子代细胞的分裂而传递下去，令孵化后的雏鸡乃至成年后的鸡都一直带有基因沉默的特性。

一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，所述以慢病毒为工具的在体基因沉默方法包括：

步骤一，利用微量进样器注射病毒；

步骤二，2天鸡胚，在气室打洞，目视确定气室膜位置，将进样器插入气室正中膜下，将病毒注入。

进一步，所述步骤一中利用5ul的微量进样器注射病毒。

进一步，所述步骤一中注射量设定为每20g蛋重注射1ul，病毒滴度统一为3x10⁸TU/ml。

进一步，所述步骤二中在气室打开直径1.5mm～2mm的洞。

进一步，所述步骤二中将进样器插入气室正中膜下1mm～2mm，将病毒注入。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述以慢病毒为工具的在体基因沉默方法建立的PPARalpha在体沉默鸡胚模型。