[发明专利]一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法

权利要求书

1.一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

(1) 利用Mu噬菌体转座子介导的随机插入技术建立M基因的高密度突变库：

利用Finnzymes公司Mu噬菌体转座子介导的随机插入突变试剂盒向流感病毒A/WSN/1933的M基因各个碱基间插入5’-NNNNNTGCGGCCGCA-3’这一15nt长的寡核苷酸序列，从而获得流感病毒M基因的高密度突变库；

(2) 通过流感病毒反向遗传学技术获得病毒突变体库：

用电转化的方法将携有M基因突变体的质粒转化入大肠杆菌DH10B感受体细胞，从重组菌种提取M基因突变体库质粒，然后利用A/WSN/33 H1N1流感病毒8质粒病毒反向遗传学操作系统获取病毒突变体库；

(3) 通过第二代测序技术对病毒突变体库组分进行分析：

取步骤(2)获得的病毒突变体库病毒在MDCK细胞上进行传代，然后利用TRIzol试剂提取病毒RNA，并对各RNA按照反转录试剂盒iScriptTM cDNA Synthesis kit进行反转录产生相应的cDNA，以该cDNA为模板，分别使用3个M基因的特异性正向引物，其序列分别为SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，与Vic标记的插入序列特异性反向引物做PCR扩增，由PCR获得的荧光标记PCR产物设置一次重复和Liz-500分子量标准利用96-毛细管3730xl DNA分析仪进行测序，所产生的数据应用ABI软件进行分析，去除PCR过程、引物及测序仪器产生的非特异性数据；

(4) 小鼠体内筛选流感病毒弱毒活疫苗候选毒株：

首先通过超速离心的方法浓缩突变体库病毒，测定其病毒滴度后用于后续小鼠感染实验，病毒通过滴鼻的方法感染6-8周龄的C57/B6小鼠，分别在感染后第二天、第四天、第六天和第八天收取小鼠的肺脏组织并进行匀浆处理，从肺组织匀浆中用TRIzol试剂提取总RNA，依照上述步骤（3）中方法对样本中病毒M基因进行测序并进行定性和定量分析，根据不同M基因突变病毒在各样本中的存在情况，确定弱毒活疫苗候选毒株；

(5) 弱毒活疫苗候选毒株遗传稳定性和安全性评价：

（a）弱毒活疫苗的分离和表型鉴定：首先对上述弱毒活疫苗候选毒株进行了单克隆化，对其中能在MDCK细胞中能够有效复制的W7-757、W7-791和W7-797三株病毒进行扩增，初步筛选出表现出更好的复制能力和较低的细胞毒性的W7-791病毒；

（b）弱毒活疫苗遗传稳定性检测：将W7-791病毒在MDCK细胞和小鼠体内进行传代，对从细胞或小鼠肺脏匀浆中获得病毒的基因序列中的M基因的序列进行测定， 确定W7-791病毒M基因的突变能够被稳定地遗传下去；

（c）弱毒疫苗的安全性评估：用不同滴度的W7-791病毒免疫6-8周龄小鼠，没发现小鼠产生体重下降及流感症状；给15日龄的新生BALB/c小鼠滴鼻接种不同滴度的W7-791或10⁴ TCID50 的野生型WSN病毒，对小鼠体重和肺脏病变进行检测，W7-791接种小鼠上未观察到像野生型WSN病毒感染小鼠那样的体重下降和肺部病变，由此确定W7-791病毒即为流感病毒弱毒活疫苗毒株。

2.根据权利要求1所述的流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，其特征在于：步骤（2）中的电转化的条件是2.0kV、200Ω、25μF。

3.根据权利要求1所述的流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，其特征在于：步骤（2）中获取病毒突变体库的具体方法是：培养的HEK293T细胞转至6孔培养板中，待细胞汇合度达到80～90％时，按照转染试剂操作说明，将含插入突变M基因的质粒和含有流感病毒其他7个基因片段的质粒等量混合，与转染试剂按比例混匀，室温孵育15 min，逐滴加入HEK293T细胞培养液中，37℃，5％CO2培养箱中培养48 h，收集转染细胞上清，并将病毒接种于MDCK细胞上进行扩增， 感染48小时后收集病毒，将部分病毒冻存以备后用。

4.根据权利要求1所述的流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，其特征在于：步骤（3）中PCR使用Novagen的PCR酶 KOD Hot-Start polymerase，PCR的反应条件是预变性95℃，10 min；变性95℃，45s；退火52℃，30s；延伸72℃，90s；运行30个循环；最后72℃延伸10 min。

5.根据权利要求1所述的流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，其特征在于：步骤（4）中确定弱毒活疫苗候选毒株的标准为：病毒在感染后能够在小鼠肺部有效地复制，但在感染后6-8天时被机体清除。