[发明专利]一种高分辨率核酸结合/熔解荧光的检测方法

权利要求书

1.一种高分辨率核酸结合/熔解荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)预测RNA-RNA相互作用区域；所述RNA-RNA包括lncRNAs及其靶基因；

所述lncRNAs及其靶基因相互作用区域的预测方法包括：利用Blast进行序列互补计算，所述序列互补计算时的参数设置为Evalue＝1e-10，identity＝90％；将所述互补计算得到的序列再利用RNAplex进行热力学上的互补计算，参数设置为e＝-40：

2)对所述步骤1)得到的RNA-RNA相互作用区域内序列进行多态性分析，筛选得到多态性位点作为靶位点；所述多态性分析的方法包括：当分析对象为模式物种时，通过物种重测序数据库进行相互作用区域内的SNPs、InDels位点的发现，所述位点在群体中的频率均大于5％；

3)以所述步骤2)得到的相互作用区域内的含1～5个靶位点的序列为模板，合成相互作用区域内的寡核苷酸片段；

4)将所述步骤3)得到的任意两条相互作用区域内的寡核苷酸片段与饱和荧光染料混合，利用Realtime-PCR进行升温处理，通过相互作用的寡核苷酸片段产生的荧光强度检测寡核苷酸序列的熔解；利用Realtime-PCR进行降温处理，通过相互作用的寡核苷酸片段产生的荧光强度检测寡核苷酸序列的结合；所述Realtime-PCR的反应条件为：RNA-RNA寡核苷酸序列升温处理体系：95℃，30s；95℃，30s，每个循环降低0.5℃，共40个循环；每个循环记录荧光强度；RNA-RNA寡核苷酸序列降温处理体系：95℃，30s；自然冷却至25℃；75℃，30s，每个循环提高0.5℃，共40个循环；每个循环记录荧光强度；

5)根据所述步骤4)得到的荧光强度绘制荧光随温度的变化曲线，曲线的峰值对应的温度代表寡核苷酸结合或熔解一半时所需要的温度；在降温处理中，所述峰值对应的温度越高，则代表RNA-RNA结合能力越强；在升温处理中，所述峰值的温度越高，则代表RNA-RNA形成的互补双链结构稳定性越强；

绘制曲线前，对荧光强度的数值进行Z-score值均一化处理，利用均一化后的数据绘制荧光变化曲线。

2.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述步骤3)寡核苷酸片段的长度为20～180bp。

3.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述步骤4)中Realtime-PCR的反应体系为：每25μl体系包括11.25μl去离子水；0.625μl10μM的寡核苷酸片段；12.50μl饱和荧光染料。

4.根据权利要求1或3所述的荧光检测方法，其特征在于，所述饱和荧光染料为LCGreen。