[发明专利]用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物、试剂盒及其应用

说明书

本申请为申请号201410790793.1、申请日2014.12.17、发明名称“用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物、试剂盒及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医学检验领域，具体涉及一种用于结核分枝杆菌感染检测的抗原刺激物及其应用、及含有该抗原刺激物的试剂盒。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的一类严重危害人类健康的传染病。虽然结核分枝杆菌最初感染人体的呼吸系统，但是它能扩散至人体几乎所有的器官并且导致相应的疾病发生。据估计，全球大约有1/3的人口感染了结核分枝杆菌，并且每年有800万新发感染病例，每年有200万人死于结核病。我国的结核疫情和结核分枝杆菌感染情况都相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二。

所述的结核分枝杆菌感染，通常是指患有活动性结核或潜伏性结核感染的人群，也可以是健康接触者。机体在感染结核分枝杆菌后，有少数发展为活动性结核，表现出相应的临床症状，如发热、咳嗽、咳痰、胸片异常等。大多数人感染后无相应的临床症状，但是机体无法清除全部的结核分枝杆菌，即为潜伏性结核感染。潜伏性结核感染者在免疫力低下等情况下可发展为活动性结核病。

结核病的早期诊断对于有效控制结核病的进展和结核分枝杆菌的传播具有重要意义。目前诊断结核感染的方法有限，主要包括结核分枝杆菌素皮肤实验(TST)、痰涂片、痰细菌培养、放射性X光片、血清学抗体抗原免疫检测以及PCR和核酸杂交法等。结核分枝杆菌感染引起的T细胞γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(interferon-gamma release assay，IGRA)是近年发展起来的新方法，可用于诊断活动性结核病和结核潜伏感染。已经得到美国FDA批准上市的T-SPOT.TB试剂盒(Oxford Immunotec Limited，Aingdon，United Kingdom)和QuantiFERON-TB Gold试剂盒都是基于IGRA原理，以RD1区基因编码的结核抗原特异性蛋白-6KD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和10KD培养滤过蛋白(CFP-10)为刺激源，通过检测外周血中结核特异性释放IFN-γ的T淋巴细胞来诊断结核感染，敏感度和特异性都较高。

目前诊断结核感染的传统方法存在较多缺点和不足，结核分枝杆菌素皮肤实验(TST)所使用的结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)中含有许多分枝杆菌种类(包括致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD诊断结核病的特异性差，不能准确区分PPD实验结果阳性究竟是因为BCG接种、接触环境中多种非结核分枝杆菌后的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染所致。痰涂片方法虽然简单易行，但是很大一部分结核病人痰里面并不一定有结核分枝杆菌(所谓的“痰阴”结核)。所以，痰涂片培养办法具有诊断阳性率低、易漏检、痰细菌培养周期长、培养成功率低(只有80％左右)等缺点。痰标本的核酸成分检测不仅面临“痰阴结核”的诊断困境而且程序复杂、容易出现假阳性。因此，免疫学技术就成了结核分枝杆菌感染诊断的重要方法。

T-SPOT.TB试剂盒和QuantiFERON-TB Gold试剂盒成份复杂、价格昂贵、成本极高，严重制约了其用于数以百万计的活动性结核患者以及数以亿计的结核潜伏感染人群进行大规模结核筛查与诊断。另外，这些试剂盒中包含的抗原肽极为复杂而且并非主要根据中国人的主要组织相容性抗原进行抗原肽的设计、筛查与验证，所以适用性与使用效果需要更进一步提升。公开号为CN 102516356 A的中国专利申请从抗原Rv3615c筛选出8-11个连续的多肽片段作为刺激源，采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)诊断结核感染，但是其灵敏度只有64％，远远达不到商品化试剂盒的要求。公开号为CN 102297968 A的中国专利申请采用的抗原刺激物是结核分枝杆菌ESAT-6抗原和CFP-10抗原的9条多肽的组合，并且使用了IFN-γ、TNF-α、IL-2、MIG和IP-10五种抗体包裹的磁珠，同时检测细胞培养上清的五种细胞因子，这就造成了其检测方法和结果分析的复杂性，并且需要使用流式细胞仪，增加了检测的成本，限制了其推广使用。公开号为CN 103604933 A的中国专利申请是基于TNF-α细胞因子ELISA检测活动性结核病的试剂盒，该试剂盒使用的抗原刺激物是ESAT-6和CFP-10整条蛋白，然而由于整条蛋白的空间构象可能会阻碍有效的抗原表位与T淋巴细胞表面的识别分子结合，并且其含有其他的抗原表位可能会产生负向调节，影响细胞因子的分泌，造成该试剂盒对潜伏感染结核的诊断效果较差。