[发明专利]一种确定鸭Hsp90α蛋白结合磷脂酰胆碱区域的方法

权利要求书

1.一种确定鸭Hsp90α蛋白结合磷脂酰胆碱区域的方法，其特征是步骤如下：

（1）鸭Hsp90α基因及各片段基因序列的获得：

a、鸭Hsp90α基因提取：取鸭胸肌100mg，提取总RNA，总RNA经电泳检测，采用核酸定量分析仪测定OD_260/280比值及浓度，以1μg总RNA为模板，按照cDNA合成试剂盒说明书进行反转录；反转录程序：37℃ 15 min，85℃ 5min，4℃保存，长期保存应放于-20℃；

b、特异性引物的设计：根据北京鸭的Hsp90α基因序列设计系列基因特异性引物，包括：上游引物F，下游引物R，以及分段用特异性引物N-F、N-R、M-F、M-R、C-F和C-R；

c、PCR扩增：以 cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测；PCR产物纯化回收后连接至pCold1载体，转化至DH5α感受态细胞，将菌液涂在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，然后挑取阳性单菌落进行培养，经菌落PCR及双酶切鉴定重组质粒，对正确的重组质粒进行测序，将测序无误的重组质粒分别转化进入表达感受态细胞Transetta2；

（2）融合蛋白原核表达及可溶性分析：以阳性重组质粒转化步骤（1）所得大肠杆菌Transetta2感受态细胞，挑取单菌落接种至5mL含100μg/mL 氨苄的 LB培养基中，37℃，200r/min震荡培养，当菌液浓度OD₆₀₀值为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.25mM，22℃，200r/min震荡诱导过夜；用不加IPTG诱导的菌液做对照，离心收集沉淀，用PBS重悬沉淀，于超声波细胞破碎仪上破碎4-6min，11000-13000r/min离心4-6min，分别取出上清、沉淀，加入SDS-PAGE 电泳上样缓冲液，95℃加热10min，用12% SDS-PAGE电泳检测融合蛋白是否为可溶性蛋白；

（3）重组融合蛋白的诱导表达及纯化：

d、诱导表达：将步骤（2）鉴定所得能可溶性表达的菌落接种于500mL含LB培养基中进行诱导表达；4400-4600r/min离心14-16min收集菌体，用pH为7.6含有50mM的磷酸盐，150mM的NaCl， 5mM的咪唑的Binding Buffer缓冲液重悬菌体，冰浴条件下超声破碎18-22min，超声参数为：功率20%，超声1s，间停3s；再11000-13000r/min离心28-32min，4℃收集上清，弃菌体沉淀；

e、初步纯化：将步骤d所得上清加入镍亲和层析柱中，用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱并收集，蛋白得到初步纯化，取样液加入SDS-PAGE 电泳上样缓冲液，95℃加热10 min，用12% SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况；

f、进一步纯化：将步骤e所得样品用10kDa的超滤管离心浓缩4℃，4000 r/min，10min/次，再用Superdex ^TM200进一步纯化，然后再次用SDS-PAGE检测纯化的产物并离心浓缩；用考马斯亮蓝染色的方法测定蛋白浓度，并至于-80℃保存；

（4）磷脂酰胆碱脂质体的制备：称取10mg磷脂酰胆碱，用2mL甲醇溶解，加0.5mL含有25mM HEPES，100mM NaCl，pH7.4的HBS缓冲液，在旋转蒸发仪中去除甲醇后加入2mL HBS，在超声波浴中乳化10min，并用HBS定溶到10mL，再-80℃反复冻融3次得到1mg/mL的脂质体；

（5）表面等离子共振技术检测鸭Hsp90α及各片段与磷脂酰胆碱的相互作用：

g、生物传感芯片L1的准备：将L1芯片安装到Biacore X100 Plus系统中，所有用到的溶液都经过0.22μm滤膜过滤；用50 mM NaOH：异丙醇体积比2:3,的混合溶液清洗3次，每次1min，流速设定为10μL·min^-1；再用pH7.4的HBS缓冲液清洗系统及芯片，流速设定为10μL·min^-1；

h、待基线平稳后，进行以下步骤：注入30μL 配好的脂质体，使脂质体偶联的L1芯片上，流速1μL·min^-1；注入50mM NaOH洗掉未偶联的脂质体1min，流速10μL·min^-1；用0.1mg/mL BSA检查芯片的亲脂基团是否饱和，如果没有BSA结合，证明L1芯片已经被脂质体饱和，用HBS缓冲液平衡芯片到基线平稳；稀释至少5个浓度的蛋白，注入到芯片上，流速30μL·min^-1；每次上完样，用合适浓度的NaOH再生芯片。

2.如权利要求1所述确定鸭Hsp90α蛋白结合磷脂酰胆碱区域的方法，其特征是：步骤（1）b所述特异性引物如下：

上游引物F：5'-CTCGGATCCATGCCTGAGGCTG T-3'，下划线是BamH1酶切位点；

下游引物R：5'-TACGTCGACATCCACCTCCTCCAT-3'，下划线是Sal1酶切位点；

N-F：5'-TTGGGATCCATGCCTGAGGCTGT-3'；

N-R：5'-GACGTCGACGAGCCTGATAGGAT-3'；

M-F：5'-CAGGGATCCATGGAGAAGTACATCG-3'；

M-R：5'-GACGTCGACAGAAACCAGGGTCT-3'；

C-F：5'-CCGGGATCCATGGAAGAAGAGAAAAAG-3'；

C-R：5'-TACGTCGACATCCACCTCCTCCAT-3'。