[发明专利]一种针对CD19的嵌合抗原受体（CAR）的重组基因构建及其应用

说明书

本发明公开一种针对CD19分子的第三代嵌合抗原受体基因的构建和应用。所述的抗原受体基因编码的重组蛋白包括如下部分：胞外区，由针对CD19抗原的串联单链可变区片段V_H和V_L和铰链区组成；跨膜区，源自CD8α；胞内区，由CD3ζ以及共刺激分子的配体CD137和CD80三个结构以不同的排列组合方式构成，三个结构之间直接连接或者由Linker连接。将所述第三代嵌合抗原受体基因片段克隆到质粒载体、慢病毒表达载体或者逆转录病毒载体，转染293细胞系等进行扩增，分离纯化后得到重组基因，转染从或者体内分离出来的T细胞，筛选出阳性克隆后增殖制备而来的CAR‑T细胞对CD19阳性肿瘤细胞具有显著的杀伤效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对CD19的嵌合抗原受体（CAR）的重组基因构建及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体( chimeric antigen receptor，CAR)技术近些年来得到快速发展，并在临床上应用于针对多种肿瘤的治疗。该技术的路线主要有3个主要步骤：

1、分离患者的T细胞，进行体外培养增值；

2、利用基因重组技术将针对肿瘤细胞抗原的抗体可变区和跨膜区以及胞内信号区重组构成新的基因，克隆到载体系统并将其转染导入到体外培养的T细胞，然后分离到阳性克隆T细胞；

3、将阳性克隆T细胞增殖后输入患者体内，使得这些T细胞识别肿瘤细胞，启动后续免疫反应来杀死肿瘤细胞；

CAR-T细胞技术用于来治疗肿瘤，最重要的特点是能够高度特异性的杀死肿瘤细胞，可以利用肿瘤细胞表面表达的特异性抗原来开发多种不同CAR。 CAR的结构主要分为胞外抗原接合区、绞链区、跨膜区和胞内信号区，其抗肿瘤效应依赖于胞外抗原结合区的靶向性、绞链区的灵活性、胞内信号区供刺激分子及T细胞活化序列的协同作用。

发明内容

本发明针对肿瘤细胞特异性的抗原CD19，开发了第三代重组的CD19嵌合抗原受体基因。

本发明采用的技术方案是：

一种针对CD19的嵌合抗原受体(CAR)重组蛋白，所述重组蛋白由三个部分串联组成，分别是胞外区，跨膜区和胞内区，其中：

所述胞外区，由针对抗原CD19的抗体可变区串联而成；

所述跨膜区，源自CD8；

所述胞内区，由三个不同来源的多肽片段排列组合串联而成。

如上所述的嵌合抗原受体(CAR)重组蛋白，优选地，编码该重组蛋白的核苷酸序列为：

(A)具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组DNA；或

(B)具有与SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列≥75％同源性的DNA序列。

如上所述的嵌合抗原受体(CAR)重组蛋白，优选地，所述重组蛋白的氨基酸序列为：

(A)具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重组蛋白质；

(B)具有与SEQ ID NO.2中所示氨基酸序列≥85％同源性的多肽或者重组蛋白质。

如上所述的嵌合抗原受体(CAR)重组蛋白，优选地，所述编码该蛋白的编码核酸是通过人工合成得到各个部分的核酸序列，然后采用PCR扩增拼接而成并克隆到表达载体上。

如上所述的嵌合抗原受体(CAR)重组蛋白，优选地，所述表达载体包括但不限于：质粒载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体。