[发明专利]对咽拭子样本或鼻咽拭子直接实时定量的PCR的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子诊断生物学技术领域，具体涉及对咽拭子样本或鼻咽拭子样本直接实时定量的PCR的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction PCR)是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应技术。该技术自从美国Cetus公司人类遗传室Kary Mullis及同事于1958年发明以来，相关的衍生技术就快速开发出来，并在微生物学，遗传病学和法医等领域中得到广泛应用。尤其在病原体检测方面，当知道某一病原体的一段基因时，根据该段基因设计特异性的引物然后进行PCR扩增，使其达到检测量，然后通过合适的检测手段，即可以确定样本中是否存在该病原体。

实时荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。与普通的PCR相比，荧光定量PCR技术检测具有特异性强，灵敏度高，重复性好，速度快，全封闭反应等优点，使其在医学、农学和临床检测学中得广泛使用。在进行荧光定量PCR检测时，首先要进行样本的核酸提取，目前核酸提取的方法主要有碱裂解法、层析柱法和磁珠法，前两种方法操作比较复杂且需要用离心机等大型设备；磁珠法操作简便，但存在多次洗脱操作导致核酸损失且存在污染风险，因此需要寻找不需要核酸提取直接PCR的方法对提高检测质量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供对咽拭子样本或鼻咽拭子样本直接实时定量的PCR的方法，以克服现有检测技术的不足，为咽拭子样本或鼻咽拭子样本提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法，不要核酸提取过程，简化了操作过程，节约了时间和成本，且能大量处理样本，操作检测时可防止污染。

为达到上述目标提供了对咽拭子样本或鼻咽拭子直接实时定量的PCR的方法，包括以下步骤：

(1)制备裂解液和PCR反应液；

(2)将咽拭子样本或鼻咽拭子样本加入到含有步骤(1)中裂解液的PCR扩增管中，再加入磁珠到PCR扩增管中，振荡摇匀混合；

(3)将步骤(2)中的PCR扩增管在80-100℃高温处理10min后冷却到室温，然后在18-28℃反应5-10min；

(4)将PCR扩增管瞬时离心后放入到磁力架中，待磁珠吸附到磁力架一侧后将上清吸出；

(5)在PCR扩增管内加入配置好的PCR反应液，进行实时定量PCR反应；

所述步骤(1)中裂解液的成分为0-2M的NaCl、0-0.3％的Triton-X和0-0.2M的KCl。

所述步骤(2)样本与裂解液的体积比为1:3—1:10。

所述步骤(3)中的高温为100℃。

所述磁珠为市售的核酸提取使用的羟基磁珠，即超顺磁性核心及无机氧化硅的外壳，优选的，平均粒径为≤1000nm的单分散性羟基磁珠。

所有反应步骤都在同一个试管内进行，本发明所述方法可以手动操作以及机械自动化操作，且不要核酸提取过程，简化了操作过程，节约了时间以及成本。

本发明的有益效果是：为咽拭子样本或鼻咽拭子样本提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法，不要核酸提取过程，简化了操作过程，节约了时间和成本，且能大量处理样本，操作检测时可防止污染。

附图说明

图1为实施例1的本发明方法应用于乙流临床样本的实时荧光定量PCR检测结果图，图中标号为1、2、3和4的四条曲线分别为1号样本、2号样本、3号样本和4号样本的实验结果；

图2为实施例2的本发明方法检测阴性的乙流咽拭子样本的敏感性结果图，图中标号为1、2、3和4的四条曲线分别为2.0×10⁴TCID₅₀/L，2.0×10³TCID₅₀/L，2.0×10²TCID₅₀/L，2.0×10¹TCID₅₀/L的样本的实验结果；

图3为实施例3的本发明方法检测阴性的乙流咽拭子样本的重复性结果图，图中标号为1、2、3、4和5的五条曲线分别是5个孔内样本的实验结果；