[发明专利]高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株，该昆虫细胞株名称为Sf9‑op‑BmBDV‑NS1，于2016年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.13289，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该细胞株能够显著提高外源蛋白的表达量，其表达的外源病毒蛋白或病毒样颗粒产物具有较强的生物活性，符合疫苗的生产要求；经过外源病毒检测、支原体检测、无菌检测、外源因子检测后，该细胞株的各种指标均符合疫苗生产用细胞基质的要求；可应用于杆状病毒和疫苗的生产。

技术领域

本发明涉及昆虫细胞株，具体涉及高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株及其构建方法和应用，属于基因工程、细胞工程技术领域。

背景技术

杆状病毒表达系统( baculovirus expression vector system，BEVS) 是将外源基因整合到杆状病毒基因组上形成重组杆状病毒，在昆虫细胞或虫体中表达外源蛋白的一种真核表达系统，它被越来越多地应用于表达生产抗体、受体、基因疫苗以及重组药物蛋白等方面。与原核表达系统相比，杆状病毒/昆虫细胞表达系统具有翻译后修饰的能力；而与哺乳动物细胞表达系统相比，杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达效率高。

在众多昆虫细胞株中，草地夜蛾卵巢细胞(Spodopterafrugiperda，Sf9)是常用来表达重组蛋白的昆虫细胞株。它既可以贴壁培养也可以悬浮培养，并可以在无血清培养基中生长良好，因此是大规模培养生产，增殖重组外源蛋白的常用昆虫细胞株。

由于杆状病毒感染昆虫细胞会引起昆虫细胞的裂解与凋亡，因此昆虫细胞的生长状态对于重组杆状病毒增殖十分重要，是重组蛋白获得高产量的重要条件之一。

发明内容

本发明的主要目的是公开一种昆虫细胞株及其构建方法，该昆虫细胞株具有良好的生长状态，能够满足重组蛋白高产量表达的需要。

为了实现这一目的，我们公开了一种高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株，该昆虫细胞株名称为Sf9-op-BmBDV-NS1，于2016年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.13289，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

该昆虫细胞株中携带有重组优化的家蚕二分浓核病毒（Bombyx moribidensovirus, BmBDV）的NS1蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所公开高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株的构建方法是将经过优化的NS1基因插入已知的表达载体，并将这一载体转染Sf9细胞后，通过抗性筛选获得稳定表达NS1蛋白的重组昆虫细胞株Sf9-op-BmBDV-NS1。具体包括以下步骤：

（1）由BmBDV病毒中获得NS1 基因，并通过对其优化获得op-BmBDV-NS1基因；

（2）将所获得的op-BmBDV-NS1基因插入已知表达载体，从而获得重组表达载体；

（3）用重组表达载体转染Sf9细胞；

（4）博来霉素Zeocin抗性筛选获得稳定表达NS1蛋白的重组昆虫细胞株Sf9-op-BmBDV-NS1。

其中步骤（2）可以进一步描述为：将所述基因op-NS1插入pIZT-V5/His载体，转化入DH5ɑ感受态细胞，采用抗生素平板筛选获得重组子，将该重组子进行酶切、电泳，鉴定为阳性的重组子所含有的重组质粒即为重组转移载体pIZT-V5/His-op-BmBDV-NS1；

同时，进一步地，步骤（3）中pIZT-V5/His-op-BmBDV-NS1 载体通过CellfectinⅡ转染Sf9昆虫细胞。