[发明专利]一种高效稳定广谱紫花苜蓿遗传转化方法

权利要求书

1.一种高效稳定广谱紫花苜蓿遗传转化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)灭菌材料的准备：

①准备好紫花苜蓿各个品种的成熟叶片；所述的紫花苜蓿品种包括中苜三号、公农二号、甘农五号、新疆大叶、保定苜蓿、阿尔冈金和敖汉苜蓿，共七个品种；

②外植体灭菌：将离体的叶片用70％乙醇浸泡30s，然后用20％的漂白剂和0.1％的SDS浸泡1.5min，最后用灭菌的蒸馏水清洗3-4遍，每次5min；

(2)农杆菌的准备：

①5ml含有农杆菌LBA4404的LB培养基在250rpm，28℃下培养24h；

②将5ml培养液放在25ml LB液体培养基中，于250rpm，28℃条件下振荡培养，直到OD值达到1.5；

③菌液在4℃，3500rpm下离心15min，弃上清，用两倍的侵染培养基重悬菌体，使最终的OD值为0.8；此过程中要注意轻柔悬浮菌体，不要涡旋；

(3)侵染：

①将灭好菌的外植体在超净台中切成4cm见方的小块，切除边缘，放到盛有侵染培养基的杯子中，切好全部外植体后，将侵染培养基倒掉，加入农杆菌悬浮液，直到没过所有外植体；

②轻轻搅动，侵染15-20min；

③将侵染完毕的外植体放到铺有灭菌滤纸的培养皿中，吹干外植体表面；

④将外植体均匀摆放在共培养培养基上，数量为10-15个/培养皿；

所述的共培养培养基的具体组分及制备条件如表1所示，

表1

(4)组织培养：

①用镊子将外植体小心摆放在共培养培养基上，在黑暗条件下培养2-4天；

②在灭菌的蒸馏水中清洗两次，晾干后继续在共培养培养基上培养4天；

③在灭菌蒸馏水中清洗三次，吹干后放在选择培养基上；

④3周左右长出愈伤，个别会长出胚状体；每隔20-25天移到新的选择培养基，根据生长情况降低或撤掉筛选压，使产生更多含有胚性愈伤的愈伤组织；

⑤将愈伤组织移到分化培养基上，3-4周后分化出胚状体，每3-4周继代一次，使其分化出更多胚状体；

⑥将胚状体移到含有抗生素的1/2MS培养基上，使形成小苗；

⑦打开培养钵盖子，炼苗3-5天，然后移到土中，温室培养；

⑧小苗足够强壮后，取部分组织进行分子检测；

所述的分化培养基的具体组分及制备条件如表2所示，

表2

2.根据权利要求1所述的高效稳定广谱紫花苜蓿遗传转化方法，其特征在于：所述的选择培养基的具体组分及制备条件如表3所示，

表3