[发明专利]一种从血液样本中富集丝状真菌的方法

说明书

本发明涉及一种从血液样本中富集丝状真菌的方法，包括：(1)从血液培养阳性培养瓶中抽取1‑2ml血液样本，注入离心管；(2)向离心管中加入50‑150mg石英砂和10‑20ml富集稀释液，混匀，静置，离心得到沉淀；(3)将沉淀震荡，离心，随后加入十二烷基硫酸钠SDS溶液和灭菌蒸馏水，震荡，除去石英砂；离心，洗涤，即得。本发明富集真菌菌丝效率高，富集到的真菌杂质少，可用于真菌核酸提取，亦可用于质谱技术直接鉴定真菌，具有广阔的应用空间。

技术领域

本发明属于血液样本处理领域，特别涉及一种从血液样本中富集丝状真菌的方法。

背景技术

随着社会人口老龄化进程加快，使罹患老年性慢性疾病的人群增加，同时，广谱抗生素广泛使用，导管介入性治疗、组织活检等侵入性医疗操作增多，以及肿瘤、艾滋病、白血病、器官移植等免疫力低下患者的数量不断扩大。因此，近年来，深部真菌感染的发病率大幅增加，特别是深部丝状真菌感染的发病率正逐年明显增加，在某些特定人群中其发病率甚至高于酵母菌感染率。由于深部真菌感染早期缺乏特征性的临床症状，难以在发病早期获得病原学诊断，当患者出现持续高热而抗生素治疗数日无效时，往往提示真菌感染已经扩散到数个器官，错过抢救患者的最佳时机；临床实践表明，不同真菌对抗真菌药物的敏感性存在较大差异，甚至部分真菌对常用抗真菌药物天然耐药或不敏感，致使真菌引起的深部感染死亡率很高。因此，及时、正确地诊断深部真菌感染、尤其是丝状真菌感染，对成功抢救患者生命，具有非常重要的现实意义。

现行临床实验室真菌检测方法相对滞后。诊断深部真菌感染的传统方法有形态学、组织病理学、血清学等方法。形态学检查包括真菌直接镜检和培养，是目前丝状真菌病诊断的最常用的方法。但，从血培养阳性的血液培养瓶转种平板至培养出丝状真菌典型菌落，一般需要3天至2周，甚至更长时间。

分子生物学技术以其灵敏度高、特异性强等优点，近年得到飞速发展，现有检测真菌感染的分子生物学方法也日益成熟，如核酸测序，基因芯片，以及采用质谱技术直接鉴定真菌。因此，从血液样本中直接富集和分离丝状真菌，采用分子生物学方法进行直接检测，而不再依赖于转种沙保弱平板获取真菌纯培养，是目前临床微生物学实验室研究的热点。然而，丝状真菌在血液中形成纤细的菌丝，且在患者循环血液中含量很少，生长缓慢。菌丝与细菌或真菌孢子不同，采用同样的实验条件，很难有效地从血液中高效地富集、分离出这类菌丝。

目前临床常用血液样本消化处理液中，溶血剂多为氯化铵、醋酸铵等为有毒或微毒物品，如刺激皮肤、粘膜、眼睛、鼻腔、咽喉，损伤眼睛；高浓度刺激肺，可导致肺积水；而且，血液样本中存在较高浓度蛋白质，甚至有淋巴细胞在血液培养瓶中继续生长、繁殖，氯化铵、醋酸铵容易引起蛋白质沉淀，使溶液浑浊，粘滞度增加，不利于丝状真菌的分离。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从血液样本中富集丝状真菌的方法，该方法富集真菌菌丝效率高，富集到的真菌杂质少，可用于真菌核酸提取，亦可用于质谱技术直接鉴定真菌，具有广阔的应用空间。

本发明的一种从血液样本中富集丝状真菌的方法，包括：

(1)从血液培养阳性培养瓶中抽取1-2ml血液样本，注入离心管；

(2)向离心管中加入50-150mg石英砂(AR级，25-50目)和10-20ml富集稀释液，混匀，静置，离心得到沉淀；其中，富集稀释液由体积比为10-30:1的80-200g/L尿素溶液(使用前配制)和500-600mM EDTA(pH 8.0)组成；

(3)将沉淀震荡，离心，随后加入十二烷基硫酸钠SDS溶液和灭菌蒸馏水，震荡，除去石英砂；离心，洗涤，即得富集的丝状真菌。

所述步骤(2)中的静置时间为5-10min。

所述步骤(3)中的十二烷基硫酸钠SDS溶液的浓度为0.5％-10％，与沉淀的体积比为1:10-15。