[发明专利]多重实时荧光PCR检测Cr(VI)还原复合菌群六种功能基因的方法

说明书

本发明提供多重实时荧光PCR检测Cr(VI)还原复合菌群六种功能基因的方法，所述复合菌群包含保藏编号为CGMCC No.3052的Pannonibacter phragmitetus BB菌、保藏编号为ATCC No.700550的Shewanella oneidensis MR‑1菌和保藏编号为ATCC No.700007的Pseudomonas putida F1菌。所述六种功能基因为BB菌的Cr(VI)还原功能基因HcrR、MR‑1菌的Cr(VI)还原酶基因OmcA、F1菌的Cr(VI)还原酶基因ChrR，以及上述三种菌的16s rDNA基因。本发明提供了一种操作简单、快捷，成本低廉的多重荧光PCR技术检测六种功能基因表达动态变化的方法，检测方法灵敏性和特异性高，检测结果准确。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体地说，涉及多重实时荧光PCR检测Cr(VI)还原复合菌群六种功能基因的方法。

背景技术

在重金属污染中Cr(VI)因其毒性大、氧化性强以及致癌性高，对人类和动植物的生命安全造成了非常大的威胁，其中Cr(VI)土壤污染问题最突出。据统计，我国受Cr(VI)严重污染的土壤面积就高达500万平方米，污染土方量约1500万立方。因此，对我国Cr(VI)污染土壤进行合理有效的修复已经迫在眉睫。

目前微生物还原Cr(VI)成为Cr(VI)污染土壤修复的热点。以Pannonibacterphragmitetus BB为主，Shewanella oneidensis MR-1和Pseudomonas putida F1的复合Cr(VI)还原菌群可以克服温度、pH、有机污染物和重金属等诸多环境因素的影响，增强还原群落刚性，提高还原效率，是目前较为高效的Cr(VI)土壤的修复方法之一。但是，传统方法在复合菌群中无法检测单一菌株的生理生长状态和Cr(VI)还原基因的表达，严重阻碍了菌群Cr(VI)还原协同机理的研究以及中试和场地微生物修复工程中菌群配方的调控。因此，亟需开发一种新的基于核酸水平的检测方法。

对于复合菌群中微生物，Naoki M.等(Fukuma N M,Koike S,KobayashiY.Monitoring of gene expression in Fibrobacter succinogenes S85 under the co-culture with non-fibrolytic ruminal bacteria.[J].Archives of Microbiology,2015,197(2):269-276.)采用16s rDNA的拷贝数和16s rRNA/rDNA的比值分别表示瘤胃中复合微生物的生长状况与代谢活性。针对基因表达的检测，常规的方法主要有Northernblotting、in situ hydridisation、RNAse protection assays、cDNA arrays和reversetranscription real-time polymerase chain reaction(RT-qPCR)。Northern blotting虽然可检测目的RNA的大小，但其操作繁琐，耗时耗力；in situ hydridisation操作复杂；RNAse protection assays主要适用于绘制转录起始和终止位点以及内含子/外显子边界，以及用于区分相似大小的相关mRNA，对于表达的定量并不适用；cDNA arrays成本高，适用性有限。以上技术还有一个共同的缺点：敏感性低，对于微量的mRNA无法有效的检测。RT-qPCR是用于检测目的基因表达量的最敏感和最灵活的方法，可用于比较不同样本群体中mRNA的水平检测，表征mRNA表达模式，区分密切相关的mRNA以及分析RNA结构。但是针对单一基因的RT-qPCR，一次只能检测一种基因的表达，同时又存在操作繁琐、费时费力等缺点，尤其是需要同时检测多个基因的情况时。为了探明菌株之间的相互影响，必须要涉及到同时检测多个基因，多重RT-qPCR技术可以实现同时检测多个基因，同时具有高特异性和敏感性、检测时间短、检测成本低等优点，是一种较为理想的检测方法。