[发明专利]一种用于检测黄龙病的环介导等温扩增引物组及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于柑橘黄龙病病原物检测技术领域，具体涉及一种用于检测黄龙病的环介导等温扩增引物组及试剂盒。

背景技术

柑橘黄龙病是世界柑橘生产上的毁灭性病害。柑橘黄龙病病原物为革兰氏阴性杆菌，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物并产生毁灭性后果，危害极大。被黄龙病病菌感染的植株无有效治愈方法，只能砍伐以防止疫情继续扩散，给养殖户带来巨大的损失。

目前针对黄龙病的诊断方法及其优缺点如下：

1、田间诊断—简易，但易混淆，不太容易与其他病害区分；

2、电镜检测—需要昂贵的仪器和实验室，容易漏检；

3、免疫学检测—需要实验室和仪器，周期长；

4、分子检测—准确快速，但前处理复杂，需要昂贵设备，对技术人员要求较高。

目前还没有一种能够快速、准确地检测黄龙病的方法。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种能够快速、准确地检测黄龙病的环介导等温扩增引物组及试剂盒。

本发明所采用的技术方案为：一种用于检测黄龙病的环介导等温扩增引物组，包括引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6，所述引物P1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物P2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物P3的序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物P4的序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物P5的序列如SEQ ID NO：5所示，所述引物P6的序列如SEQ ID NO：6所示。

其中，SEQ ID NO：1的序列为：TCATGCCATCAGATGTGC；

SEQ ID NO：2的序列为：GTAACGTCAATTGCTGCG；

SEQ ID NO：3的序列为：CCGTAGGAGTCTGGACCGTGCTGGTCTGAGAGGATGA；

SEQ ID NO：4的序列为：CCATGCCGCGTGTATGAAGATATTAACCACAACACCTTCCTC；

SEQ ID NO：5的序列为：TCAGTTCCAGTGTGGCTG；

SEQ ID NO：6的序列为：GGCCTTCGGGTTGTAAAGTA。

本申请的发明人，根据黄龙病病菌特有的靶序列，设计出一对内引物(引物P1和引物P2)、一对外引物(引物P3和引物P4)和一对环引物(引物P5和引物P6)，能够特异性识别靶序列上的8个独立区域，利用特异性聚合酶启动循环链置换反应，在基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物，用于后续的定性和定量分析。

本发明还提供了一种含有所述环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括反应浓缩液和逆转录酶；所述反应浓缩液包括DNA聚合酶，酶缓冲液，dNTP，MgSO₄，甘氨酸三甲胺内盐和荧光染料。

所述试剂盒能够快速、准确的检测出柑橘是否被黄龙病病原物感染。

使用所述试剂盒检测黄龙病病原物的方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：取疑似感染黄龙病的柑橘叶片，破碎后提取核酸并稀释，作为样品；

(2)引物处理：将引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6等体积混合，得到引物试剂，在混合前，所述引物P1和引物P2的浓度为40nM，引物P3和引物P4的浓度为5nM、引物P5和引物P6的浓度为20nM；

(3)环介导等温扩增反应：将样品、引物试剂和反应液混合均匀后，放入等温扩增荧光检测系统，在65℃下，进行环介导等温扩增反应30分钟；

(4)溶解曲线分析：在环介导等温扩增反应过程中，对cDNA的浓度进行分析，得到扩增曲线和溶解曲线；

(5)结果判断：根据所获得扩增曲线和溶解曲线判定，若扩增曲线为明显的S型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显S型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显S型曲线，但溶解曲线峰型不单一，则判定为非特异性扩增。

需要说明的是，核酸的等温扩增法属于核酸体外扩增诸多方法中的一类，在核酸扩增过程中温度恒定不变，即不需要环境温度的反复变化即可完成DNA的复制和扩增，其技术的核心在于其独特的引物结构和扩增方式以及具有特殊活性的DNA聚合酶的使用，本申请中使用的是等温扩增荧光法。