[发明专利]用于RPA快速检测携带喹诺酮类耐药基因的铜绿假单胞菌的引物

说明书

本发明公开用于RPA快速检测携带喹诺酮类耐药基因的铜绿假单胞菌的引物及其应用。本发明设计的引物具有较好的种间特异性和种内保守性，该技术能在一次反应中检测出铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因(qnrS)，短时间内可判断该菌是否为携带喹诺酮类耐药基因(qnrS)的铜绿假单胞菌，无假阳性的出现，也无需昂贵仪器，因此更加便捷、高效、准确。扩增后片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)的引物及其应用，具体涉及一种可同时检测出铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因(qnrS)的RPA快速检测的引物。

背景技术

铜绿假单胞菌是医院内感染的主要病原菌之一。患血液病、代谢性疾病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。通过医护人员可将病菌传给病人，特别在灼伤和新生儿重症监护室，是重要的医院内病原菌。除医院内获得感染外，HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染，而且一旦被铜绿假单胞菌感染，常可出现晚期HIV感染的体征。如今由于广谱抗生素、激素以及免疫抑制剂的广泛使用，铜绿假单胞菌对多种抗生素快速产生耐药性在临床抗感染的一线战场己是不争的事实，对庆大霉素、头孢噻甲羧肟、哌拉西林等亦早己产生不同程度的耐药性，这就使得临床的抗感染治疗显得越来越困难。而喹诺酮类药物由于其敏感性极强，作用范围广，毒性低，价格适中的特点被广泛的使用于铜绿假单胞感染病症的治疗中，然而近年来的研究发现其耐药菌发生率逐年增高，大量耐药菌株的存在和流行使得由铜绿假单胞所引起疾病的发病率和死亡率不断增加。这一现象引起世人的广泛关注，因此我们急需一种快速准确、特异性强、灵敏度高的的现代检测手段来检测耐药铜绿假单胞菌。

目前铜绿假单胞菌的检测主要包括培养皿法-酶法(β-葡萄糖苷酸酶分析)、免疫法(抗原搜寻)、基因法(基因搜寻)，但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想。在近些年来科学家的不断探究中，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)检测方法应运而生，它在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。研究人员只需根据所研究的样品在对应的生物靶标基因序列中设计RPA对应的特异性引物与探针(引物长度通常需要达到30-38个碱基)，利用单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶(Polynerase)等三种特定酶，只需在25～43℃的恒温条件下，便可实现特定核酸序列的扩增且能在5～20min观察到结果。对比我们常用的PCR技术，RPA的反应更加快速便捷，实现恒温无需不同的温度环节，对实验仪器的依赖性低，可降低实验成本，实现野外实时检测。RPA的结果可通过琼脂凝胶电泳检测来读取，也可以通过试纸条进行读取。

应用RPA技术对样品中铜绿假单胞菌中喹诺酮类耐药基因进行研究，在恒温条件下5-20分钟内对靶基因进行有效扩增，在检测铜绿假单胞菌的同时还可检验铜绿假单胞菌中的喹诺酮类耐药基因，对携带喹诺酮类耐药基因的铜绿假单胞菌的研究提供科学依据和理论基础，在医药卫生，公共卫生等方面有着重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可同时检测铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因(qnrS)的RPA快速检测的引物序列。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

为实现上述目的，本发明根据铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因(qnrS)的特征靶基因设计出2对特异性引物F1/R1、F2/R2,见表1。各特异性引物具有高度种内保守、种间特异性等优点。扩增后片段长度大小各异，铜绿假单胞菌扩增后产物大小为416bp，喹诺酮类耐药基因(qnrS)扩增后产物大小为202bp，可通过电泳进行分开辨别。

表1、RPA快速检测特异性引物序列

具体检测方法包括以下步骤：