[发明专利]用于志贺氏菌及四环素耐药基因的RPA快速检测的引物

说明书

本发明公开用于志贺氏菌及四环素耐药基因的RPA快速检测的引物。本发明设计的引物具有较好的种间特异性和种内保守性，该反应能特异性检测出目标基因并同时能分别鉴定志贺氏菌(褔氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌)及四环素耐药基因(tetM)，而避免假阳性的出现；本发明根据四环素耐药基因(tetM)设计了一对特异性引物，根据褔氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌基因的同源性设计了一对引物，因此2对引物可以扩增出3条目的基因，与传统方法比较，引物数量大为减少(传统方法扩增3条目的基因需要3对引物)，从而减少了假阳性的出现。扩增后片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测志贺氏菌及四环素耐药基因的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)的引物及其应用，具体涉及一种可在样品中同时检测出褔氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、四环素耐药基因(tetM)的RPA快速检测的引物。

背景技术

志贺氏菌病(Shigellosis)又称细菌性痢疾，是志贺菌属痢疾杆菌(褔氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌等)引起的一种急性肠道传染病，具有高度传染性和严重危害性，主要易感人群为5岁以下儿童和免疫障碍人群。痢疾感染患者常有腹痛、腹泻、粘液性脓血便、发热，严重患者还可能伴随有肾脏衰竭和神经毒性等危及生命的症状，严重危害人类的健康和生命安全。而且，如今抗生素的大量滥用，导致各类食源性病原菌的耐药菌株日益增多，四环素类抗生素作为一类广谱抗生素，因其价格低廉、作用范围广泛、毒性低等优点，曾广泛地应用于畜禽抗菌促生长剂和人医、兽医和植物细菌性感染的防治，导致许多细菌都对其产生严重的耐药性。志贺氏菌作为人兽共患病原菌，目前已产生了严重的耐药性，尤其对四环素耐药性较多。大量耐药菌株的存在和流行，使得本病的发病率和死亡率都不断上升，引起世人的广泛关注。因此亟需建立一种操作简便、快速准确、灵敏度和特异性都较高的现代化检测志贺氏菌的方法。而目前，志贺氏菌的快速检测方法主要有常规检测法、快速生化仪器检测法、分子生物学检测方法、毒素检测法、环介导恒温扩增技术和酶联免疫检测法等，但因它们操作程序复杂、检测时间长、耗资大、准确度不高且特异性差，很难适应现代化食品安全快速检测的需要。所以我们需要努力找到一种更好的快速检测方法来代替它们。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)作为近年来开发的核酸扩增技术，相比经典PCR技术，RPA技术主要优势之一在于等温。常规PCR必须经过不同温度环节，而RPA反应在常温下即可进行反应。优势之二在于检测耗时短。整个过程在10-20分钟内即可完成，且无需变性。优势之三在于灵敏。RPA技术在缩短反应时间的同时也保持了高灵敏性。优势之四在于结果读取多样化。RPA结果可通过琼脂糖凝胶电泳检测，也可类似real-time PCR对扩增过程进行实时监控，还可以通过试纸条读取结果。

本方法采用RPA技术对样品中褔氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌及四环素耐药基因(tetM)进行研究，在保证灵敏、特异的同时，操作简单、耗时短，能够在常温下10～20分钟内对靶DNA进行扩增，在检测志贺氏菌(褔氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌)的同时也可检测四环素耐药基因(tetM)。对耐四环素志贺氏菌的分子流行病基础提供理论基础和科学依据，在兽医、食品卫生和公共卫生等方面具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可同时检测褔氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌及四环素耐药基因(tetM)的RPA快速检测的引物序列。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

为实现上述目的，本发明根据志贺氏菌(褔氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌)及四环素耐药基因(tetM)的特征靶基因设计出2对特异性引物F1/R1、F2/R2，见表1，其中褔氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌共用一对引物F1/R1。各特异性引物具有高度种内保守、种间特异性等优点。扩增后片段长度大小各异，褔氏志贺氏菌扩增后产物大小为186bp，宋内氏志贺氏菌扩增后产物大小为253bp，四环素耐药基因(tetM)扩增后产物大小为534bp，可通过电泳进行分开辨别。