[发明专利]一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法及相应细胞

权利要求书

1.一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法，其包括如下步骤：

S1：对大鼠成体肝干细胞进行扩增、培养并保存；

S2：采用基因转染技术将含有Notch1基因的慢病毒载体转入大鼠成体肝干细胞，采用大鼠Notch1胞内段(Notch1 intracellular domain，NICD) 进行扩增；选择Rat Notch1-NICD序列：NM_001105721 .1进行扩增，采用扩增引物序列：

Notch1-Rat-F1：5 'AAAGAGTGAGACGGTGGAGCCT 3 '

Notch1-Rat-R1：5 'TTTGGTCGCCCCAGCATC 3 '

Notch1-Rat-F2：

5 'ATAGTCTAGAGCCACCATGGTGCTGCTGTCCCGCAAG 3 '

Notch1-Rat-R2：

5 'ACCGGAATTCTCACTTAAATGCCTCTGGAATGTGGG 3 '；

获得稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞；

S3：利用稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞，采用选择性条件培养法进行培养，使其在体外进一步分化，筛选出致瘤能力强及稳定的肝癌细胞；具体包括如下步骤：

(1)稳定过表达细胞及其对照组扩增到 80％-90％覆盖瓶底时开始进行选择性条件培养；首先弃去瓶中旧液，清洗后加入选择性条件培养液,随后放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养；依据培养瓶中旧液的情况决定是否换液，通常间隔48小时-60小时全量换液1次；

(2)选择性条件培养持续4周结束后，显微镜下观察细胞形态学变化情况及细胞边界是否清晰，细胞是否形成团块，并拍照记录；首先弃去瓶中旧液，清洗后，加入消化液进行消化，加入选择性条件培养液中和，用吸管吹打至所有细胞脱壁，把细胞悬液转移至离心管中，进行室温离心，弃去上清液，加入选择性条件培养液，吹打均匀后等分至多个培养瓶，每瓶补充培养基后，将培养瓶放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱中；其中1瓶细胞继续进行选择性条件培养；

(3)选择性条件培养4周时间为1周期，持续培养细胞10个周期；

S4：采用筛选的肝癌细胞，通过同种属的原位肝脏移植瘤模型，可在肝脏形成肝癌，并伴自发形成双肺转移瘤，从而获得高转移肝癌细胞；

所述选择性条件培养液是在改良Richter培养液基础上进一步添加相关成分而获得，即选择性条件培养的改良Richter培养液；配方为：以改良的 Richter培养基为基础培养基：含L-谷氨酰胺，2mg/IL- 脯氨酸及50ug/mL庆大霉素，不含胰岛素、HEPES及酚红；在前者基础上添加碳酸氢钠、HEPES、胰岛素，胎牛血清；各添加物的终浓度为：2 .6mM碳酸氢钠，20mM HEPES，4 .0mg/L胰岛素，10％胎牛血清；0 .22μm过滤器除菌，4℃保存，即可获得选择性条件培养液。

2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，通过基因测序确认所述Notch1胞内段基因插入所述慢病毒载体。

3.如权利要求2所述的方法，其中，步骤S2中，通过观察GFP阳性率，并利用Westernblot检测Notch1过表达效果，建立稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其中，通过观察细胞形态变化情况，筛选出细胞形态学上稳定的肿瘤细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤S3中，通过免疫组织化学方法确定裸鼠皮下肿瘤类型为肝癌细胞。

6.一种采用权利要求1-5之一所述方法制备的细胞株，其保藏编号：CCTCCNO.C201730。