[发明专利]一种植物茎秆中木质素单体的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种植物茎秆中木质素单体的测定方法。

背景技术

木质素是植物体中仅次于纤维素的酚类聚合体，是细胞壁的重要组成部分，填充于纤维素框架中增强植物体的机械强度，增强其抗性。研究表明，木质素的存在提髙了小麦、水稻、油菜、玉米、荞麦等重要粮食作物的茎秆抗倒伏能力。

木质素主要由香豆醇、芥子醇和松柏醇三种单体通过聚合形成的对-羟基苯基木质素(H木质素)、紫丁香基木质素(S木质素)和愈创木基木质素(G木质素)三种木质素组成。因此，为了深入研究植物茎秆中H、G、S木质素单体形成机理，需要建立一种准确的方法来测定植物茎杆中木质素单体的含量。中国专利CN104535678A公开了一种梨果皮中木质素单体含量的测定方法，从而快速准确的测定了梨果皮中木质素单体的含量。植物茎秆中木质素含量与作物的倒伏密切相关，木质素含量的多少决定作物的抗倒伏能力强弱，而木质素则由H、G和S木质素单体组成，测定木质素含量必须测定这三种单体的含量，目前关于植物茎秆中木质素单体含量的测定方法未见报道。

发明内容

本发明是提供一种植物茎秆中木质素单体的测定方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种植物茎秆中木质素单体的测定方法，包括以下步骤：

1)植物茎秆收获后在65-70℃的烘箱中完全烘干，用小型粉碎机粉碎后过60-80目筛；

2)取0.07-0.10g样品置于5mL离心管中，加1.5-2.0mL80％乙醇，充分涡旋5-10min，10,000-12,000rpm离心8-10min，倒掉上清液，此步骤重复3次；

3)加入1.5-2.0mL氯仿/甲醇为2:1的混合液，充分涡旋3-5min，10,000-12,000rpm离心8-10min，倒掉上清液；

4)加入500-600mL丙酮，在30-35℃的氮吹仪上吹干；

5)加入1.5-2.0mLpH5.0的0.1mol/L的醋酸钠缓冲液，盖上盖子后，置于80-85℃的水浴锅中热击30-40min；

6)置于-4-0℃的冰浴中冷却5-10min；

7)加入35-40μL0.01％NaN3，35-40μL淀粉酶，3-4μL支链淀粉酶，盖上盖子充分涡旋3-5min后，置于37℃的摇床上12-16h；

8)100℃热击10min,终止消化，10,000-12,000rpm离心8-10min，倒掉上清液；

9)加入500-600mL丙酮，在30-35℃的氮吹仪上吹干备用；

10)称取上述吹干备用的样品5-8mg，置于密封性好的玻璃管中，加入1mL2.5％BF₃,10％EtSH，87.5％二氧六环混合液，轻轻摇晃，给玻璃管中充满氮气置换掉管中全部的空气后立马盖上盖子；

11)在100℃条件下加热4h，每隔1h轻轻摇晃1次；

12)置于冰上冷却5-8min，终止反应；

13)加入0.4mol/L NaHCO₃0.3-0.4mL调节上层液相的pH为3-4；

14)加入2mL超纯水、0.2mL二十四烷及0.8mL乙酸乙酯，静置10-15min；

15)快速吸取上层的有机相300-400μL转移至新的离心管中，确保没有带入水；

16)置于30-35℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于200-300μL丙酮中；

17)置于30-35℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于400-500μL乙酸乙酯中，用0.22μm有机滤膜过滤；

18)吸取过滤后的溶液100-200μL，向里面加入20-40μL吡啶，100-200μLN,O-双三甲基硅基乙酰胺，在25-30℃室温下静置2-3h后，取2-3μL进行气相色谱-质谱联用仪分析；

19)根据分子离子峰来定性，其中质荷比239为H木质素单体，质荷比269为G木质素单体,质荷比299为S木质素单体，根据内标二十四烷的浓度、内标峰面积，样品浓度、样品峰面积，从而计算出样品中三种木质素单体的含量。

上述步骤4)，步骤9)，步骤16)，步骤10)，步骤17)需要在通风橱内进行。

上述步骤10)中2.5％BF₃,10％EtSH，87.5％二氧六环混合液要现配现用。

上述步骤14)中二十四烷的浓度为0.5mg/ml，用乙酸乙酯溶解。