[发明专利]一种Sema 4D-VEGF涂层的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种Sema 4D‑VEGF涂层的构建方法及应用，其步骤包括，A、醌基活性层的制备；B、基底材料表面氨基化；C、Sema 4D纳米复合物的固定；D、功能因子VEGF的装载；本发明构建出Sema 4D‑VEGF协同作用下的快速内皮化的微环境，通过该方法对心血管材料表面进行生物修饰实现材料的诱导组织修复及快速内皮化功能。

技术领域

本发明涉及生物医用材料表面改性领域，具体涉及一种Sema 4D-VEGF涂层的构建方法及应用。

背景技术

心血管系统疾病是危害人类健康的重要疾病之一，人工植入血管支架或心脏瓣膜是治疗心血管疾病的有效方法；目前全世界每年大约超过200万冠心病病人需要进行经皮穿刺冠状动脉成形术，其中70％需要植入血管支架；我国2006年接受血管支架植入治疗的患者也逾10万次；我国心脏瓣膜病约占心脏病患者30％，每年也有十万以上危重病人必须施行人工心脏瓣膜置换术。

肝素(Heparin)在临床上常被用作抗凝剂，主要用于治疗血栓症、血栓静脉炎及血栓栓塞症；肝素结构中含有大量的硫酸根基团，是目前发现的负电性最强的生物分子；Sema4D是细胞膜表面锚定蛋白，广泛存在如血小板、T细胞等表面，其胞外蛋白水解产物Sema 4D具有促进内皮细胞迁移以及免疫调节的作用；Sema 4D的受体有plexin B1和CD72，前者主要存在于内皮细胞表面，而后者主要存在于免疫细胞中，Sema 4D功能主要通过作用相应受体而实现；大量研究表明，肝素与各种生长因子的结合能够对生长因子起到保护作用，延缓生长因子的半衰期，并促进生长因子和其受体间的识别和结合；目前还没有发现利用细胞膜表面锚定蛋白Sema 4D和血管内皮因子VEGF协同作用构建微环境的技术。

发明内容

本发明提供一种装载VEGF功能因子并能够与Sema 4D协同作用的涂层，可促进内皮细胞迁移和增值，加速内皮化进程。

本发明采用的技术方案是：一种Sema 4D-VEGF涂层的构建方法，包括以下步骤：

A、基底材料表面抛光清洗后用1-4mg/ml的盐酸多巴胺溶液，室温条件下浸泡反应12-24小时后，清洗；浸泡清洗过程重复2-5遍形成醌基活性层；

B、步骤A中的醌基活性层用2.5mg/ml的多赖氨酸(PLL)4℃条件下浸泡处理12h，清洗；

C、将50-400ng/ml的Sema 4D与浓度为5-10mg/ml的Heparin等体积混合，37℃条件下反应2-4h形成Sema 4D纳米复合物，将步骤B中处理后的样品浸没于Sema 4D纳米复合物中4℃条件下反应12-24h，清洗；

D、将步骤C中得到的样品浸于200-400ng/ml的VEGF溶液中，在4℃条件下反应24-48h，清洗后既得目标产物。

进一步的，所述步骤A中的基底材料为钛或钛合金。

进一步的，所述步骤A中基底材料清洗采用纯净水超声清洗3min。

进一步的，所述步骤A、B、C、D中样品的清洗采用磷酸盐缓冲液进行。

进一步的，所述步骤B中多赖氨酸分子量为150-300KDa。

一种Sema 4D-VEGF涂层的应用，诱导受损组织修复和内皮化。

本发明的有益效果是：

(1)本发明将功能因子Sema 4D和VEGF通过肝素间接固定于材料表面，肝素和Sema4D的结合形成纳米复合物能够延缓Sema 4D的半衰期，并对Sema 4D起到保护作用，避免被蛋白酶降解，同时肝素能够促进Sema 4D、VEGF与其相应受体间的识别与结合，保证Sema 4D和VEGF功能的发挥；

(2)本发明Sema 4D和VEGF双因子协同作用加速机体血管创伤修复；