[发明专利]产腈水解酶的酵母菌株选育及其在腈类化合物生物转化中的应用

说明书

本发明属于工业生物技术领域，特别涉及一种腈水解酶产生酵母菌的筛选方法及其在腈类化合物生物转化制备3‑羟基丙酸中的应用。本发明提供了一种产腈水解酶的酵母菌的筛选方法，首次筛选到了一株可转化3‑羟基丙腈合成3‑羟基丙酸的酵母菌株3H2‑2，结合形态、生理生化特性以及18S和ITS测序分析，将其鉴定为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)。该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏编号CGMCC No.12935)。添加3％葡萄糖作为能源物质，利用该菌株游离细胞对3‑羟基丙腈进行转化实验，能将500mM 3‑羟基丙腈完全转化，3‑羟基丙酸累积浓度可达到216.3mM。季也蒙毕赤酵母CGMCC 12935具有生命力强、腈转化能力突出等特点，为3‑羟基丙酸的合成建立了一种新工艺；本工艺具有反应条件温和、能耗低、环境友好等特点。

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，特别涉及一种腈水解酶产生酵母菌的筛选方法及其在腈类化合物生物转化制备3-羟基丙酸中的应用。

背景技术

腈水解酶能将腈类底物中的腈基转化为羧基从而制备得到有机酸、氨基酸等化合物，在大宗化学品、食品添加剂和医药中间体等领域具有重要应用。自1964年Robinson等人首次从土壤中分离到一株产蓖麻碱腈水解酶的假单胞菌属Pseudomonas菌株以来，不同来源的腈水解酶已经得到广泛研究，日本学者采用红球菌Rhodococcus rhodochrous J1产腈水解酶，可水解多种腈类化合物制备得到有机酸。自此，不同来源的腈水解酶产生菌逐渐见诸报道，包括红球菌属Rhodococcus，诺卡氏菌属Nocardia，不动杆菌属Acinetobacter，产碱杆菌属Alcaligenes，假单胞菌属Pseudomonas，短根瘤菌属Bradyrhizobium，丛毛单胞菌属Comamonas，芽胞杆菌属Bacillus，火球菌属Pyrococcus，盐单胞菌Halomonas，节杆菌属Arthrobacter，嗜热芽胞菌Geobacillus，棒状杆菌Corynebacterium等各种不同来源的细菌；镰刀菌Fusarium，曲霉Aspergillus和青霉菌Penicillium等来源的真菌。这些文献报道的利用腈水解酶获得的化合物包括烟酸、扁桃酸、丙烯酸、羟基乙酸、亚氨基二乙酸以及多种非天然氨基酸等。这些报道中，以细菌来源的腈水解酶为主，而真菌腈水解酶则相对报道较少，尤其是来源于酵母菌的腈水解酶更是鲜有报道。

3-羟基丙酸，是一种三碳无手性化合物，具有羟基和羧基两个官能团，与乳酸互为同分异构体，是很多光学活性物质的前体；作为一种重要平台化合物，被用于众多医药化工产品的生产中，是合成大分子化合物和聚合物的重要单体。2004年美国能源部将3-羟基丙酸列为当今世界12种最具开发潜力的化工产品之一，具有重要的开发价值，近年来也逐步受到关注。3-羟基丙酸的传统生产方法主要通过化学法进行。一般利用氰化钾与邻卤代醇反应，生成3-羟基丙腈，再通过Reformatsky反应生成3-羟基丙酸；在高温下，丙烯酸可发生水合反应合成3-羟基丙酸；此外，也可利用铂金和一种固体酸催化剂ZSM5zeolite分别催化3-羟基丙醛和丙烯酸生成3-羟基丙酸；总结来看，化学法合成步骤相对复杂，对设备要求高，且产品分离纯化流程繁琐，生产成本相应较高。

近年来发展的生物法中利用微生物发酵生产3-羟基丙酸，则可有效避免化学合成法所带来的不利因素，且具有原料来源丰富，绿色环保，生产成本低等优势。结合基因工程手段可以较好实现3-羟基丙酸的生产。利用基因工程菌株生产3-羟基丙酸的方法按照底物的不同主要包括两类：一类是以谷物类碳水化合物葡萄糖为底物；一类是以三碳化合物甘油为底物。而在野生菌生产3-羟基丙酸的研究中，如1，3-丙二醇、丙酸、丙烯酸、3-氨基丙酸等作为底物均有报道。但生物发酵法需要辅酶参与，并且产率和产物纯度不高，同时菌体对高浓度底物耐受能力偏低。利用腈水解酶一步催化腈类物质3-羟基丙腈制备3-羟基丙酸是一种可替代性技术，该方法步骤简单，避免了中间产物的影响，而且该工艺具有反应条件温和、能耗低、环境友好等技术优势。迄今为止，尚未见酵母属菌株，尤其是季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii产腈水解酶用于3-羟基丙酸合成的报道。